Friday, January 31, 2014

Bloqueando a via MAPK para tratar a acondroplasia

Introdução

Quando comecei este artigo, pensei em ir diretamente ao ponto: vamos falar imediatamente sobre o
interessante estudo sobre a inibição da MAPK nas placas de crescimento de ratos.

Então, lembrei-me do objetivo deste blog, que é de compartilhar informações sobre terapias potenciais para a acondroplasia com pessoas que nem sempre estão familiarizadas com a linguagem técnica. Os dezessete leitores deste blog podem reclamar com alguma razão, oh! não, ele está repetindo tudo de novo .... Peço desculpas, existem eventuais visitantes lendo um artigo pela primeira vez e creio que o blog é para eles também. É por isso que vamos começar com um breve e básico resumo sobre a acondroplasia. E, finalmente, eu sempre tento incluir algo novo nos artigos.

A causa da acondroplasia

A acondroplasia é causada por um único erro (uma mutação) na estrutura do gene que codifica (guarda a informação para produzir) uma proteína chamada de receptor do fator de crescimento de fibroblastos 3 (FGFR3). A mutação do gene provoca a substituição de um único aminoácido na cadeia desta proteína. Esta única mudança, tecnicamente chamada G380R, a substituição de um aminoácido chamado glicina por outro chamado arginina, faz o FGFR3 mais ativo do que o normal e produz as características clínicas da acondroplasia. (1)

Apesar de ter importância chave durante o desenvolvimento da nova vida no útero, após o nascimento, o FGFR3 é produzido de uma maneira relevante quase por apenas um tipo de célula, os condrócitos
das placas de crescimento, estreitas zonas muito especializadas localizadas nas extremidades dos ossos longos (Figura 1). Essas regiões são onde o crescimento ósseo ocorre durante a infância e a puberdade. Quando o indivíduo atinge uma marca específica de seu próprio relógio biológico, no final da puberdade, as placas de crescimento se fecham e o indivíduo pára de crescer.

Figura 1 . Zonas da placa de crescimento


EuroGrow.net
O FGFR3 em ação

O FGFR3 é uma proteína ativa, por isso é chamado de enzima. Uma enzima é um tipo de mensageiro elétrico, que transporta sinais de e para a célula, para permitir que responda ao ambiente ou às próprias necessidades. O FGFR3 é normalmente ativado somente por um pequeno número de FGFs presentes no tecido da placa de crescimento (matriz extracelular) e funciona nos condrócitos reduzindo a velocidade com que essas células se multiplicam e amadurecem. (1) Sem o FGFR3 os ossos crescem excessivamente e problemas de desenvolvimento também surgem. (2,3) O blog contém outros artigos de revisão do modo de ação do FGFR3. Você só tem que visitar página no índice da sua língua preferencial, clicando no respectivo botão no topo desta página.

O FGFR3 atua em conjunto com outras enzimas para exercer seus efeitos, através do que chamamos cascatas ou vias de sinalização. Em condrócitos, o FGFR3 pode ativar várias cascatas, mas tem ficado cada vez mais evidente, de acordo com vários estudos, que a cascata chamada
proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) é fundamental para as consequências clínicas da acondroplasia (Figura 2). (leia a ref.1 para uma boa revisão)

Figura 2. A via FGFR3- MAPK (ERK) em condrócitos
  
O paradoxo da MAPK

Se você está seguindo a sequência de artigos do blog já deve ter lido sobre a ação paradoxal da MAPK em condrócitos: enquanto em praticamente todas as outras células a cascata MAPK é um gatilho de crescimento, em condrócitos ela inibe o crescimento celular. (4; visite os dois últimos artigos de série do blog) Aqui, podemos fazer uma parada e perguntar: se a sinalização da MAPK é responsável por inibir o crescimento ósseo na acondroplasia, podemos tratar a acondroplasia usando drogas contra a cascata MAPK ? Vamos ver. 


MAPK na acondroplasia

Como disse, há evidências se acumulando que mostram que a inibição da via MAPK pode restaurar, ao menos parcialmente, o crescimento ósseo em displasias ósseas associadas ao  FGFR3. A evidência vem, por exemplo, a partir de vários estudos realizados com o peptídeo natriurético tipo C (CNP) e seu análogo BMN-111. (5-9)

O CNP é um regulador natural da actividade do FGFR3 nos condrócitos, reduzindo os efeitos da sinalização do FGFR3. O CNP funciona
precisamente inibindo a enzima RAF no início da via MAPK (Figura 3). (5)

Figura 3. As vias do FGFR3 e do CNP



No entanto, o CNP é apenas uma abordagem possível que pode ser utilizada para inibir a via da MAPK naacondroplasia. Outra estratégia poderia ser a utilização de drogas atualmente em desenvolvimento clínico ou já aprovadas para o tratamento de algumas formas de câncer. Isso é possível ?

Inibindo a MAPK no câncer

Aproveitando do principal sinal da via MAPK (a instrução para crescer e sobreviver), vários tipos de câncer utilizam esta cadeia para crescer através de diversos mecanismos, tais como:

1. Aumentando a produção de várias enzimas receptoras diferentes, como o FGFR3, que utilizam a MAPK para conduzir sinais. Os cientistas chamam isso super expressão ou amplificação. Ter mais receptores na parede celular é uma vantagem para a célula que quer multiplicar;

2 . Produzindo enzimas mutantes e hiperativas. Lembre-se que no último artigo mencionei que alguns tipos de câncer ganham a habilidade de produzir uma forma mutante do FGFR3 associado à displasia tanatofórica que o torna sempre ativo. As mutações também pode acontecer em qualquer enzima da cascata MAPK para torná-la mais ativo do que o normal.

Um bom exemplo de como as células cancerosas são "espertas" vem do melanoma. Este tipo agressivo de câncer de pele muitas vezes tem uma mutação na RAF, chamada V600E, o que torna mais fácil para as células do melanoma crescer mais rapidamente, porque a RAF mutada funciona sem a necessidade de um estímulo extracelular. (10) Os investigadores começaram a testar diversos compostos contra a RAF anos atrás, e agora drogas que inibem RAF, como o vemurafenib, já estão aprovadas para o tratamento do melanoma. (11)

No entanto, o melanoma é tão adaptável que depois de algum tempo respondendo ao tratamento com um anti-RAF, torna-se resistente à droga. É por isso que, para lidar com esta situação, há novas estratégias que adicionam um anti-MEK ao inibidor da RAF para tratar o melanoma. (12,13).

Projetado para "atacar" componentes da cascata MAPK, esses novos medicamentos potenciais são qualificados de acordo com seus alvos, então medicamentos contra a RAF são chamados de inibidores da RAF e medicamentos contra a MEK são chamados de inibidores da MEK (Tabela 1). Você vai ver que os mais avançados no desenvolvimento clínico ou já aprovados adotam nomes incluindo os seus alvos, assim vemuRAFenib, dabRAFenib e soRAFenib são inibidores da RAF ou anti-RAF e traMEtinib e soluMEtinib são inibidores MEK ou anti-MEK.

Tabela 1. Uma lista de
inibidores da RAF e da MEK disponíveis para testes de laboratório ou em desenvolvimento clínico

A lista não é completa. Alguns destes compostos não são específicos para MEK ou RAF.
Fonte: Santa Cruz Biochemicals, Ref 14
Inibindo a MAPK para tratar a acondroplasia

Então, existem medicamentos aprovados para o tratamento de alguns tipos de câncer que se beneficiam da função pró- proliferação da MAPK. Por que não poderíamos testá-los na acondroplasia ? Isso é possível? Quais são os riscos ? Quais seriam os desafios para estimular a indústria farmacêutica a explorar esta estratégia?

Drogas novas e antigas no câncer

O câncer é uma doença devastadora. As células cancerosas crescem sem controle e invadem a vizinhança, podem prejudicar a função de um órgão ou tecido, competem por nutrientes e energia e, sem qualquer intervenção, irão conduzir o organismo à morte.

Nestas circunstâncias, não é difícil entender por que tratamentos agressivos e tóxicos são aceitáveis ​​para o tratamento do câncer. Fármacos antigos usados ​​para tratar tumores tradicionalmente atuam em todo o processo de proliferação celular, chamado mitose, de forma que têm impacto não só sobre as células cancerosas, mas também no desempenho das células normais em suas tarefas habituais, que incluem multiplicar-se, a fim de manter
saudável o tecido em que estão​​. É por isso que as drogas mais velhas causam tantos efeitos colaterais indesejados nos pacientes, tais como, às vezes, sintomas gastrointestinais graves: as células da mucosa do sistema digestório tem um ciclo celular rápido, sempre se multiplicando para manter o tecido intacto.

Medicamentos da nova geração são classificados em um novo grupo: eles são chamados de terapias alvo-dirigidas . Em vez de afetar a célula como um todo, visam  apenas
alvo (s) específicos, como as enzimas localizadas na membrana celular, tais como FGFRs ou as cascatas de sinalização, tais como a MAPK. Com este modo mais específico de ação, temos visto uma queda significativa na gravidade dos efeitos indesejáveis ​​em pacientes que utilizam esses novos medicamentos.

Vários tipos de cânceres pediátricos também usam as propriedades da cascata MAPK para induzir o crescimento celular, mas não vemos pesquisa com essas novas drogas nesta população. A grande questão é: qual seria o risco de usar esses tipos de drogas em crianças, cujos corpos estão em desenvolvimento ?

As enzimas da cascata MAPK participam de um vasto número de processos celulares vitais. Quais seriam as consequências da utilização de um anti-MEK por uma criança com acondroplasia ou outra condição genética, tais como as Rasopatias (14), que podem se beneficiar com a utilização destas drogas ? A aversão a assumir riscos sempre impediu a indústria farmacêutica a testar essas terapias-alvo, como os inibidores da MAPK, em crianças com câncer. Bem, pelo menos até recentemente.

O
anti- MEK selumetinib no câncer pediátrico

A visão parece estar mudando em termos de interpretação de risco. A Astazeneca vem desenvolvendo o
anti-MEK selumetinib (AZD6244) para o câncer em adultos onde a inibição da MEK pode ajudar a combater a doença, mas também começou a testar o selumetinib em alguns tipos de câncer pediátrico. Existem três estudos clínicos registrados no ClinicalTrials.gov (NCT01362803, NCT01386450, NCT01089101) com o selumetinib. Esta é uma iniciativa rara e arrojada, dados os riscos reais ou potenciais envolvidos ou estimados.

Como parte das regras do processo de desenvolvimento de medicamentos, desenvolvedores de drogas devem divulgar os resultados dos estudos realizados com um
candidato a remédio. Em muitos casos, testar uma droga para o câncer em um organismo em desenvolvimento poderia parecer arriscado porque as drogas que combatem o câncer atuam em muitos aspectos da máquina de crescimento. Se um composto experimental foi testado em modelos animais jovens, esses testes terão de ser apresentados às autoridades regulatórias. Testes como esses podem trazer resultados inesperados, que podem ser vistos como negativos para o sucesso da potencial nova droga. É por isso que o estudo recentemente publicado por El-Hoss e colaboradores (14) é tão especial.

Até onde sei, este é o primeiro estudo publicado mostrando os efeitos sobre ossos e placas de crescimento de drogas como o selumetinib e o PD0325901, que são anti-Meks em desenvolvimento clínico, destinados a tornar-se medicamentos comerciais. Existem vários estudos com outros anti-Meks, mas com compostos que foram retirados do programa clínico, como o U0126.


Efeitos do selumetinib e do PD0325901 na placa de crescimento

El-Hoss e colaboradores fizeram um número expressivo de experimentos com o objetivo de entender quais são os efeitos desses dois compostos anti-MEK no osso e na placa de crescimento. Basicamente, confirmaram que ambos os inibidores mas, principalmente o  PD0325901, inibiram a MAPK em condrócitos de ratinhos normais. A inibição da MEK causou um alargamento da zona hipertrófica da placa de crescimento, mas não mostrou qualquer efeito na zona proliferativa (veja a figura 1 com as zonas da placa de crescimento). Além disso, eles observaram que as placas de crescimento não alargaram, e para eles isso foi causado porque os condrócitos deixaram o estado proliferativo mais cedo. Em outras palavras, eles concluíram que havia mais condrócitos hipertróficos ao custo de menos células em proliferação, um resultado que não seria considerado bom.

Estes primeiros resultados são apenas parcialmente semelhante às experiências com o CNP. O CNP também aumentou a zona hipertrófic , mas houve um aumento global do tamanho da placa de crescimento, que correspondeu ao crescimento de osso observado nos modelos animais, de acordo com os estudos já citados aqui (5-9). Os investigadores do CNP observaram que a zona proliferativa da placa de crescimento foi marginalmente estimulada sob exposição ao CNP ou análogos. A ausência de efeito mais forte em condrócitos em proliferação pode ser explicado pelo fato de que o FGFR3 também exerce ação através de outras vias de sinalização, não influenciadas pelo CNP.

Por exemplo, existe evidência de que a sinalização do FGFR3 inibe a produção de uma proteína local chamada
proteína relacionada ao paratormônio (PTHrP; alguma se referem a ele como um peptídeo), que é um forte estimulador da proliferação de condrócitos, atrasando a sua maturação (hipertrofia). (15) Por que a exposição ao CNP e aos anti-Meks resultou em diferentes achados continua a ser uma boa pergunta.

El-Hoss et al. também fizeram testes em ratos e observaram que a inibição da MAPK também favoreceu a densidade óssea por meio da redução da atividade dos osteoclastos (células que absorvem o tecido ósseo). Estes medicamentos também influenciaram o processo de cicatrização óssea em um modelo de fratura, mantendo a
cartilagem do calo  mais tempo do que nos animais controle. Eles descobriram que isso estava acontecendo por causa da inibição da liberação de um tipo de enzima que degrada a matriz da cartilagem a fim de dar espaço ao osso novo no calo.

El-Hoss et al. observaram que os efeitos do selumetinib e do PD0325901 na placa de crescimento foram reversíveis após a interrupção das drogas, dando uma perspectiva positiva sobre as consequências a longo prazo do uso dessas drogas para o câncer pediátrico.

Os autores admitem algumas limitações do estudo, como o período relativamente curto de exposição a que os animais foram submetidos aos medicamentos, apenas três semanas.

É curioso que eles não mencionaram se mediram os animais para ver se havia alguma diferença entre os
comprimentos totais e de membros entre os animais testados e os controles, tavez exatamente por causa do curto período de observação.

Conclusões

Creio que só a publicação dos testes feitos com o selumetinib e o PD0325901 é um avanço significativo e parece representar uma mudança na forma como a indústria está lidando com os desafios do desenvolvimento de drogas e os riscos, reais ou imaginários, na população pediátrica. Suspeito que isto tem uma conexão com a recente mudança nos requisitos regulatórios para drogas potenciais destinadas a ser utilizadas no segmento pediátrico. Em poucas palavras, os medicamentos a serem usados ​​por crianças devem ser testados primeiro nesta mesma população.

Os resultados do estudo de El-Hoss e colaboradores são de certa forma intrigantes e acho que eles deveriam suscitar mais estudos, específicos sobre as placas de crescimento, para permitir uma melhor compreensão do tipo de influência que estes compostos anti-MAPK exercem no desenvolvimento e crescimento ósseos. Mais importante ainda, os testes feitos por El-Hoss et al. foram realizados em ratinhos normais. Qual seria o efeito desses anti-Meks em um modelo de acondroplasia ? Se houver interesse suficiente, esses testes devem ser feitos em um modelo animal apropriado, por um período de tempo adequado. Acho que os resultados seriam diferentes.

O futuro ...


Outro aspecto que merece ser mencionado é que, para futuras estratégias terapêuticas não que visem diretamente o FGFR3 para resgatar o crescimento ósseo na acondroplasia, podemos especular que poderia ser necessário combinar diferentes drogas para a obtenção de resultados terapêuticos significativos. Por exemplo, adicionando um fármaco pró - proliferação, tal como o PTH, com um fármaco pró-hipertrofia, tal como um anti-MEK ou um análogo do CNP. Em um exercício de futurologia, combinações de drogas podem permitir doses em geral mais baixas e menores riscos em uma terapia de longo prazo para as crianças com acondroplasia.

Referências


1. Foldynova-Trantirkova S et al. Sixteen years and counting: the current understanding of fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) signaling in skeletal dysplasias. Hum Mutat 2012; 33:29–41. Acesso livre.

2. Colvin J et al. Skeletal overgrowth and deafness in mice lacking fibroblast growth factor receptor 3. Nature Genetics 1996; 12:390-7.

3. Toydemir RM et al. Novel mutation in FGFR3 causes camptodactyly, tall stature, and hearing loss (CATSHL) Syndrome. Am J Hum Genet 2006;79(5):935-41.
Acesso livre.

4. Krejci P. The paradox of FGFR3 signaling in skeletal dysplasia: why chondrocytes growth arrest while other cells over proliferate. Mut Res 2013; http://dx.doi.org/10.1016/j.mrrev.2013.11.001.
Acesso livre.

5. Krejci P et al. Interaction of fibroblast growth factor and C-natriuretic peptide signaling in regulation of chondrocyte proliferation and extracellular matrix homeostasis. J Cell Sci 2006; 118: 5089-00. 
Acesso livre.
 
6. Nakao K et al. Impact of local CNP/GC-B system in growth plates on endochondral bone growth. Pharmacol Toxicol 2013; 14 (Suppl 1):48. 
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7. Yasoda A et al. Systemic Administration of C-Type Natriuretic Peptide as a Novel Therapeutic Strategy for Skeletal Dysplasias. Endocrinology 2009;150: 3138–44.
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8. Yasoda A and Nakao K. Translational research of C-type natriuretic peptide (CNP) into skeletal dysplasias. Endocrine J 2010; 57 (8): 659- 66. 
Acesso livre.
 
9. Lorget F et al. Evaluation of the therapeutic potential of a CNP analog in a Fgfr3 mouse model recapitulating achondroplasia. Am J Hum Genet 2012;91(6):1108-14. 
Acesso livre.

10. Lito P et al. Tumor adaptation and resistance to RAF inhibitors. Nature Med 2013;19: 1401–9.
Acesso livre

11. Fisher R and Larkin J. Vemurafenib: a new treatment for BRAF-V600 mutated advanced melanoma Cancer Manag Res 2012:4; 243-52.
Acesso livre.

12.Grimaldi AM et al. The role of MEK inhibitors in the treatment of metastatic melanoma. Curr Opin Oncol 2014 Jan 13. [Epub ahead of print]

13.Tidyman WE and Rauen KA. The RASopathies: Developmental syndromes of Ras/MAPK pathway dysregulation. Curr Opin Genet Dev 2009; 19(3): 230–36.
Acesso livre.

14. El-Hoss J et al. Modulation of endochondral ossification by MEK inhibitors PD0325901 and AZD6244 (Selumetinib). Bone 2014;59:151-61.

15. Chen LA et al. Ser(365)-->Cys mutation of fibroblast growth factor receptor 3 in mouse downregulates Ihh/PTHrP signals and causes severe achondroplasia.Hum Mol Genet 2001; 1;10(5):457-65.
Acesso livre.

Monday, January 27, 2014

Blocking the MAPK cascade to treat achondroplasia

Introduction

When I started this article I thought that I would be going directly to the point: let's talk immediately about the interesting study about MAPK inhibition in mice growth plates. 

Then, I remembered the purpose of this blog, which is to share information about potential therapies for achondroplasia with people that are not always familiar with the technical language. The seventeen readers of this blog may complaint with some reason, oh! no, he is repeating everything again.... I must apologize, there have been eventual visitors reading an article for the first time and I think on them, too. That's why we will begin with a short, basic information about achondroplasia. And finally, I always try to include something new. 

The cause of achondroplasia 

Achondroplasia is caused by a single mistake (a mutation) in the structure of the gene encoding (carrying the information to produce) the protein called fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3). The gene mutation provokes the substitution of a single amino acid in the chain of this protein. This single change, technically called G380R, the replacement of an amino acid called glycine for another called arginine, makes FGFR3 more active than normal and induces the clinical features of achondroplasia. (1)

While having key importance during the development of the new life in utero, after birth, FGFR3 is produced in a relevant way almost by just one kind of cell, the chondrocytes of the growth plates, thin and very specialized zones placed in the extremities of the long bones (Figure 1). These regions are where the bone growth occurs during childhood and puberty. When the individual reaches a specific mark on his or her own biological clock, at the end of puberty, the growth plates close and the individual stops to grow.

Figure 1. Growth plate zones

Naski MC & Ornitz DM. Frontiers of Bioscence 1998
FGFR3 in action

FGFR3 is an active protein, so it is called an enzyme. An enzyme is a kind of electric messenger, carrying signals from and to the cell to let it respond to the environment or to its own needs. FGFR3 is normally activated by a small number of FGFs present in the growth plate environment (the extracellular matrix) and works in chondrocytes by reducing the speed these cells multiply and mature. (1) Without FGFR3 bones grow excessively and development problems also arise. (2,3) The blog contains other articles reviewing FGFR3 mode of action. You just have to visit your preferential language index page by clicking the respective button in the top of this page.

FGFR3 acts in concert with other enzymes to exert its effects, through what we call signaling cascades or pathways. In chondrocytes, FGFR3 can activate several cascades, but it has becoming more evident, according to several studies, that the cascade called mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway is key for the clinical consequences of achondroplasia (Figure 2). (read ref. 1 for a good review)

Figure 2. FGFR3- MAPK (ERK) pathway in chondrocytes


The MAPK paradox

If you are following the blog's article sequence you may have already read about the paradoxical action of MAPK in chondrocytes: while in about all other cells the MAPK cascade is a growth trigger, in chondrocytes it impairs cell growth. (4; visit the last two series' articles of the blog) Here, we could make a stop and ask: if MAPK signaling is responsible for impairing the bone growth in achondroplasia, can we treat achondroplasia using drugs against the MAPK cascade? Let's see if we could do it.

MAPK in achondroplasia 

As I said, there is increasing and compelling evidence showing that the inhibition of the MAPK pathway can restore, at least partially, the bone growth in FGFR3-related bone disorders. Evidence comes, for instance, from several different studies performed with C-type natriuretic peptide (CNP) and its analogue BMN-111.(5-9)

CNP is a natural regulator of FGFR3 activity in chondrocytes, reducing the effects of FGFR3 signaling. CNP works precisely inhibiting the enzyme RAF in the beginning of the MAPK pathway (Figure 3). (5)

Figure 3. FGFR3 and CNP pathways


Nevertheless, CNP is just one possible approach that can be used to inhibit the MAPK pathway in achondroplasia. Another strategy could be to use drugs currently in clinical development or already approved to treat some forms of cancer. Is this feasible?

Inhibiting MAPK in cancer

Taking advantage of the main MAPK pathway signaling (the instruction to grow and survive), several types of cancer use the MAPK pathway to grow through diverse mechanisms, such as:

1. Increasing the production of several different receptor enzymes like FGFR3 that use MAPK to conduct signals. Scientists call this over expression. Having more receptors on the cell wall is an advantage for the cell that wants to multiply;

2. Producing mutated and overactive enzymes. Remember that in the last article I mentioned that some cancers gain the ability to produce a mutated form of FGFR3 associated to tanatophoric dysplasia that makes it always active. Mutations also can happen in any enzyme of the MAPK cascade to make it more active than normal.

One good example of how cancer cells are "smart" comes from melanoma. This type of aggressive skin cancer often has a mutation in RAF, called V600E, which makes easier to melanoma cells to grow faster, because the mutated RAF works without the need of an extracellular stimulus.(10) Researchers started to test several compounds against RAF years ago, and now drugs that target RAF, like vemurafenib, have already been approved to treat melanoma. (11)

However, melanoma is so adaptable that after sometime responding to the treatment with an anti-RAF, it becomes resistant to the drug. That's why, to deal with this situation, there are new strategies adding an anti-MEK to the RAF inhibitor to treat melanoma. (12-13).

Designed to aim components of the MAPK cascade, these new potential medicines are qualified according to their targets, so drugs against RAF are called RAF inhibitors and drugs against MEK are called MEKs inhibitors (Table 1). You will see that those advanced in clinical development or already approved adopt names including their targets, so vemuRAFenib, dabRAFenib and soRAFenib are RAF inhibitors or anti-RAF and traMEtinib and soluMEtinib are MEK inhibitors or anti-MEK.

 Table 1. A list of RAF and MEK inhibitors available for lab tests or in clinical development

The list is not exhaustive. Some of these compounds are not specific to MEK or RAF. 
Source: Santa Cruz Biochemicals, Ref 14
 Inhibiting MAPK to treat achondroplasia 

So, there are drugs approved to treat some kinds of cancer which benefit from the pro-proliferation function of MAPK. Why could we not test them for achondroplasia? Is it possible? What are the risks? What would be the challenges to stimulate a pharma industry to explore this strategy?

Old and new drugs in cancer 

Cancer is a devastating disease. Cancer cells grow without control and invade the surroundings, disrupt an organ or tissue function, compete for nutrients and energy and, without any intervention, they will drive the organism to death.

Under these circumstances, it is not difficult to understand why aggressive and toxic treatments are acceptable to treat cancer. Old drugs used to treat tumors traditionally aim the whole cell proliferation process, called mitosis, so they can impact not only cancer cells but also normal cells performing their normal tasks, which include to multiply in order to keep the tissue where they are healthy. That's why the older drugs cause so many undesired side effects in patients, such as sometimes severe gastrointestinal symptoms: the cells of the digestive system mucosa have a fast cell cycle, always multiplying to keep the tissue intact.

New generation drugs are classified in a new group: they are called targeted therapies. Instead of affecting the cell as a whole they aim just specific target(s), like the enzymes located at the cell membrane, such as FGFRs or in the signaling cascades, like MAPK. With this more specific mode of action, we have seen a significant drop in the severity of undesired effects in patients using those new drugs.

Several types of pediatric cancers also use MAPK cascade properties to induce cell growth but we don't see research with these new drugs in this population. The great question is: what would be the risk of using these kinds of drugs in children, whose bodies are in development? 

Enzymes of the MAPK cascade participate in a vast number of vital cell processes. What would be the consequences of using an anti-MEK in a child with achondroplasia or other genetic condition such as the Rasopathies (14) that could benefit with the use of these drugs? The aversion to take risks has always prevented the pharma industry to test these targeted therapies, like MAPK inhibitors, in children with cancer. Well, at least until recently.

The anti-MEK selumetinib in pediatric cancer 

Things seem to be changing in terms of interpretation of risk. Astazeneca has been developing the anti-MEK selumetinib (AZD6244) for adult cancers where the inhibition of MEK may help fight the disease, but has also started testing selumetinib in some types of pediatric cancers. There are 3 clinical studies registered at ClinicalTrials.gov (NCT01362803, NCT01386450, NCT01089101). This is a rare and bold initiative, given the real or potential risks involved or perceived.

As part of the rules of the drug development process, drug developers must disclose the results of the studies performed with a candidate drug. In many instances, testing a drug for cancer in a developing organism could sound risky because drugs for cancer work in many aspects of the growth machinery. If one such experimental compound was tested in young animal models, those tests would have to be presented to the regulatory authorities. Tests like these may bring unexpected results that could be perceived as negative for the success of the potential new drug. That's why the recently published study by El-Hoss and coworkers (14) is so special. 

To my knowledge, this is the first study published showing the effects on bone and growth plates of drugs like selumetinib and PD0325901, which are anti-MEKs in clinical development, intended to become commercial drugs. There are several studies with other anti-MEKs, but with drugs that have been withdrawn from the clinical program, such as U0126.

Selumetinib and PD0325901 effects in the growth plate

El-Hoss and coworkers have done a lot of experiments aiming to understand what are the effects of these two anti-MEK compounds in the bone and in the growth plate. Basically, they confirmed that both inhibitors, but mainly PD0325901, inhibited MAPK in chondrocytes from normal mice. MEK inhibition caused enlargement of the hypertrophic zone of the growth plate but showed no effect in the proliferative zone (see figure 1 for the growth plate zones). Moreover, they observed that the growth plates didn't enlarge at all, and for them this was caused by chondrocyte leaving the proliferative state earlier. In other words, they concluded that there were more hypertrophic chondrocytes at the cost of less proliferative ones, an outcome that would not be considered a good one.

These first findings are only partially similar to the experiments with CNP. CNP also increased the hypertrophic zone, but there was an overall increase of the growth plate size, which responded for the bone growth observed in animal models, according to the reports already cited here (5-9). CNP investigators observed that the proliferative zone of the growth plate was marginally stimulated under exposure to CNP or analogues. The absence of more robust effect in proliferative chondrocytes may be explained by the fact that FGFR3 also exerts effects through other signaling pathways, not influenced by CNP at all. 

For instance, there is evidence that FGFR3 signaling inhibits the production of a local protein called parathyroid hormone related protein (PTHrP; some refer to it as a peptide), which is a strong chondrocyte proliferation stimulator, delaying their maturation (hypertrophy). (15) Why exposure to CNP and to those anti-MEKs resulted in different findings remains a good question.

El-Hoss et al. also made tests in mice bones and observed that MAPK inhibition also favored bone density through reduction of osteoclasts activity (the cells that absorb bone tissue). These drugs also influenced the bone healing process in a fracture model, maintaining the cartilage callus longer than in control animals. They found that this was happening because of the inhibition of the release of a type of enzyme that degrade the cartilage matrix to leave space for the new bone.

El-Hoss et al. observed that the effects of selumetinib and PD0325901 in the growth plate were reversible after drug interruption, giving a positive perspective about long term consequences of using those drugs for pediatric cancer.

The authors admitted some study limitations, such as the relative short period of exposure the animals were submitted to, only three weeks. 

It is curious that they didn't mention if they measured the animals to see if there was any difference in the total and limb lengths between control and tested animals, possibly exactly because of the short observation period.

Conclusions

I think that just the publication of the tests made with selumetinib and PD0325901 is a breakthrough advancement and seems to represent a change in the way the industry is dealing with drug development challenges and risks, real or imagined, in the pediatric population. I suspect that this has a connection with the recent change in the regulatory requirements for potential drugs intended to be used in the pediatric segment. In few words, drugs to be used by children must be tested first in the same population.

The results of the study by El-Hoss and coworkers are somehow intriguing and I think they should elicit more studies, specific on growth plates, to allow a better understanding of the kind of influence these anti-MAPK compounds exert in bone development and growth. More importantly, the tests done by El-Hoss et al. were performed in normal mice. What would be the effect of those anti-MEKs in an achondroplasia model?  If there was enough interest, these tests should be done in an appropriate animal model, for an appropriate period of time. I guess results would be different.

The future...

Another aspect worth to mention is that for future therapeutic strategies not targeting directly FGFR3 to rescue bone growth in achondroplasia, we could speculate that it might be necessary to combine different drugs to obtain meaningful therapeutic results. For instance, adding a pro-proliferative drug, such as PTH, to a pro-hypertrophic drug, such as an anti-MEK or a CNP analogue. In an exercise of futurology, drug combinations could allow overall lower doses and lesser risks in a long term therapy for children with achondroplasia. 

References

1. Foldynova-Trantirkova S et al. Sixteen years and counting: the current understanding of fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) signaling in skeletal dysplasias. Hum Mutat 2012; 33:29–41. Free access.

2. Colvin J et al. Skeletal overgrowth and deafness in mice lacking fibroblast growth factor receptor 3. Nature Genetics 1996; 12:390-7.

3. Toydemir RM et al. Novel mutation in FGFR3 causes camptodactyly, tall stature, and hearing loss (CATSHL) Syndrome. Am J Hum Genet 2006;79(5):935-41. Free access.

4. Krejci P. The paradox of FGFR3 signaling in skeletal dysplasia: why chondrocytes growth arrest while other cells over proliferate. Mut Res 2013; http://dx.doi.org/10.1016/j.mrrev.2013.11.001. Free accesss.

5. Krejci P et al. Interaction of fibroblast growth factor and C-natriuretic peptide signaling in regulation of chondrocyte proliferation and extracellular matrix homeostasis. J Cell Sci 2006; 118: 5089-00. Free access.
 
6. Nakao K et al. Impact of local CNP/GC-B system in growth plates on endochondral bone growth. Pharmacol Toxicol 2013; 14 (Suppl 1):48.
Free access.
 
7. Yasoda A et al. Systemic Administration of C-Type Natriuretic Peptide as a Novel Therapeutic Strategy for Skeletal Dysplasias. Endocrinology 2009;150: 3138–44.
Free access.
 
8. Yasoda A and Nakao K. Translational research of C-type natriuretic peptide (CNP) into skeletal dysplasias. Endocrine J 2010; 57 (8): 659- 66.
Free access.
 
9. Lorget F et al. Evaluation of the therapeutic potential of a CNP analog in a Fgfr3 mouse model recapitulating achondroplasia. Am J Hum Genet 2012;91(6):1108-14. Free access.


10. Lito P et al. Tumor adaptation and resistance to RAF inhibitors. Nature Med 2013;19: 1401–9. Free access. 

11. Fisher R and Larkin J. Vemurafenib: a new treatment for BRAF-V600 mutated advanced melanoma Cancer Manag Res 2012:4; 243-52. Free access.

12.Grimaldi AM et al. The role of MEK inhibitors in the treatment of metastatic melanoma. Curr Opin Oncol 2014 Jan 13. [Epub ahead of print]

13.Tidyman WE and Rauen KA. The RASopathies: Developmental syndromes of Ras/MAPK pathway dysregulation. Curr Opin Genet Dev 2009; 19(3): 230–36. Free access.

14. El-Hoss J et al. Modulation of endochondral ossification by MEK inhibitors PD0325901 and AZD6244 (Selumetinib). Bone 2014;59:151-61. Epub 2013 Nov 20.

15. Chen LA et al. Ser(365)-->Cys mutation of fibroblast growth factor receptor 3 in mouse downregulates Ihh/PTHrP signals and causes severe achondroplasia.Hum Mol Genet 2001; 1;10(5):457-65. Free access.

Friday, January 24, 2014

Por que os condrócitos param na acondroplasia? parte 2

Introdução

No último artigo regular do blog analisamos uma hipótese interessante formulada pelo Dr. Pavel Krejci, um dos mais entusiasmados investigadores das propriedades moleculares do receptor do fator de crescimento de fibroblastos 3 (FGFR3), para explicar por que o FGFR3, um estimulador de crescimento conhecido para a maioria da células do corpo, funciona no sentido oposto em condrócitos. (1)

Em resumo, o FGFR3 é um freio natural para o crescimento de condrócitos, ajudando estas células, os mestres do crescimento ósseo, a regular seu próprio ritmo de proliferação (multiplicação). A mutação G380R no FGFR3, a causa da acondroplasia (2), faz com que esta enzima fique mais ativa do que o normal, forçando assim os condrócitos a parar de multiplicar e amadurecer, causando a parada do crescimento ósseo. A ação normal do FGFR3 em condrócitos é importante para o crescimento normal do osso: se não houvesse o FGFR3, os ossos cresceriam excessivamente e também surgiriam consequências ruins. (3,4)

Vimos também que o FGFR3 funciona através de uma série do que chamamos de cascatas de sinalização para exercer seus efeitos nos condrócitos e uma dessas cascatas, a da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) parece ser de relevância fundamental no crescimento ósseo (figura 1; [5]). 

A MAPK estimula o crescimento celular

A cascata MAPK é um fator positivo chave para a proliferação, crescimento,sobrevivência e especialização para a maioria das células do corpo, incluindo as células cancerígenas. (6)

Figura 1. Via de sinalização FGFR3-MAPK (ERK)




Como vimos no último artigo, em condições normais, a célula possui mecanismos de controle de qualidade que são ativados quando algo parece estar errado com as suas funções, por exemplo, quando recebe estímulos de crescimento demais. Isso faz com que a célula "interprete" esses estímulos excessivos como perigosos e ligue o sistema de controle. (7)

Pelo contrário, no câncer esses controles são perdidos e as células se multiplicam livremente. Em alguns tipos de câncer, as células cancerosas começam a produzir um FGFR3 que apresenta a mesma mutação que, quando ocorre de forma espontânea, causa um tipo mais grave e letal de displasia óssea, chamada de displasia tanatofórica (TD). Na TD, o FGFR3 é tão ativo que não precisa ser acionado por um FGF, está sempre ligado e trabalha sozinho (o que é chamado de ativação constitutiva). (8) Isso faz com que a via FGFR3-MAPK fique extremamente ativa, conduzindo a célula cancerosa a se multiplicar sem controle.

MAPK em condrócitos

Condrócitos parecem ser uma exceção à regra da MAPK: em vez de crescer sob a influência da via FGFR3-MAPK, reduzem seu ritmo de crescimento e, de acordo com Dr. Krejci, isto ocorreria porque os condrócitos utilizariam o sistema de controle de qualidade para reagir ao estímulo dado por essa cascata de sinalização. (1,9) As células que utilizam este sistema de controle entrariam no que é chamado de estado de senescência celular: elas manteriam algumas funções celulares, mas não seriam mais capazes de multiplicar (sem multiplicação de condrócitos = sem crescimento ósseo).

Como mencionamos no artigo anterior, este conceito poderia ser questionado: a mutação faz com que condrócitos entrem em senescência, mas não é a função normal do FGFR3 reduzir o ritmo de crescimento dos condrócitos? O fenômeno da senescência está sendo ativado nos condrócitos, mesmo sob a influência da atividade de um FGFR3 normal?

Estive pensando sobre este problema ultimamente e não consegui encontrar uma resposta certa para estas perguntas. Senescência celular é muitas vezes mediada por uma famosa proteína controladora chamada p53. Ela trabalha com um par de outras proteínas e juntas são consideradas mestres desse tipo de controle de proliferação. (7) Além disso, já se sabe que os condrócitos, sob a influência da sinalização iniciada pelo FGF, também desencadeia sistema de controle de crescimento mediado pela proteína p107. (10) Por fim, tem sido também demonstrado que os membros da família de proteínas Sprouty podem inibir o FGFR3 e outras enzimas celulares e também podem desencadear a senescência. (11) No entanto, é difícil dizer por que, em condições normais (pense no FGFR3 normal) esse controle seria ligado em condrócitos e estaria exacerbado em células portadoras do receptor mutante. Como isso acontece?

Já sabemos que o FGFR3 é apenas um dos muitos outros fatores que controlam o ritmo do crescimento ósseo, a maioria deles atuando como moduladores positivos, incluindo o paratormônio e seu peptídeo relacionado (PTH, PTHrP), o peptídeo natriurético tipo C (CNP), o hormônio de crescimento/fator de crescimento semelhante a insulina 1 (GH/IGF-1), entre outros.

Talvez, a soma de todos estes estímulos positivos, adicionado pelo estímulo extra dado por FGFR3 (lembre que oFGFR3 é um estimulador de crescimento para outras células) é o gatilho destes sistemas de controle de crescimento dos condrócitos. A questão é, seja dirigida por p53, p107 ou proteínas Sprouty esses sistemas são os mesmos em todas as células, então por que os condrócitos se comportam diferentemente?

Bom, isso ainda tem que ser demonstrado. 

Uma nota final 

No último artigo disse que o próximo seria sobre a abordagem da via MAPK para tratar a acondroplasia. Este é o terceiro artigo ou nota que publiquei aqui desde então. O tópico sobre a senescência dos condrócitos é muito importante e não pude deixar de pensar um pouco mais sobre ele. No próximo artigo, estaremos finalmente analisando mais de perto o uso de inibidores da MAPK que estão sendo explorados no tratamento do câncer, para tratar a acondroplasia. 

Referências

1. Krejci P. The paradox of FGFR3 signaling in skeletal dysplasia: why chondrocytes growth arrest while other cells over proliferate. Mut Res 2013; http://dx.doi.org/10.1016/j.mrrev.2013.11.001.

2. Bellus GA et al. Achondroplasia is defined by recurrent G380R mutations of FGFR3. Am J Hum Genet 1995;56(2):368-73. Acesso livre.

3. Colvin J et al. Skeletal overgrowth and deafness in mice lacking fibroblast growth factor receptor 3. Nature Genetics 1996; 12:390-7.

4. Toydemir RM et al. Novel mutation in FGFR3 causes camptodactyly, tall stature, and hearing loss (CATSHL) Syndrome. Am J Hum Genet 2006;79(5):935-41.
Acesso livre.

5. Foldynova-Trantirkova S et al. Sixteen years and counting: the current understanding of fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) signaling in skeletal dysplasias. Hum Mutat 2012; 33:29–41.
Acesso livre.

6. Santarpia L et al. Targeting the mitogen-activated protein kinase RAS-RAF signaling pathway in cancer therapy. Expert Opin Ther Targets 2012; 16(1): 103–19.
Acesso livre.

7. Campisi J & Fagagna FA. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Rev Mol Cell Biol 2007;8:729-40.

8. d'Avis PY et al. Constitutive activation of fibroblast growth factor receptor 3 by mutations responsible for the lethal skeletal dysplasia thanatophoric dysplasia type I. Cell Growth Differ 1998;9(1):71-8.
Acesso livre.

9. Krejci et al. FGFR3 signaling induces a reversible senescence phenotype in chondrocytes similar to oncogene-induced premature senescence. Bone 2010; 47:102–10. 
Acesso livre sob certas condições.

10. Kolupaeva V et al.The B55α regulatory subunit of protein phosphatase 2A mediates fibroblast growth factor-induced p107 dephosphorylation and growth arrest in chondrocytes. Mol Cell Biol 2013;33(15):2865-78.



11. Macià A et al. Sprouty1 induces a senescence-associated secretory phenotype by regulating NFκB activity: implications for tumorigenesis. Cell Death Differ 2014; 21(2):333-43.
 

Monday, January 20, 2014

Why do chondrocytes stop in achondroplasia? part 2

Introduction

In the last regular article we have reviewed an interesting hypothesis formulated by Dr. Pavel Krejci, one of the most enthusiastic investigators of the fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) molecular properties, to explain why FGFR3, a known growth stimulator for most of the cells of the body, works in the opposite direction in chondrocytes. (1)

In brief, FGFR3 is a natural brake for chondrocyte growth, helping this cell, the master of bone growth, to regulate their own proliferation (multiplication) pace. The G380R mutation in FGFR3, the cause of achondroplasia (2), makes this enzyme more active than normal, thus forcing the chondrocytes to just stop multiplying and maturing, making the bone to stop growing. The usual action of FGFR3 in chondrocytes is important for normal bone growth: if there was no FGFR3, then bones would grow excessively and bad consequences would also arise. (3,4)

We also saw that FGFR3 works through a number of what we call signaling cascades to exert its effects in chondrocytes and one of these cascades, the mitogen activated protein kinase (MAPK) pathway seems to be of key relevance in bone growth (figure 1;[5]). The MAPK cascade is a key positive driver of cell proliferation, growth, specialization and survival in most cells of the body, including cancer cells. (6) 



Figure 1. FGFR3 - MAPK (ERK) signaling pathway


As we saw in the last article, in normal conditions, the cell has quality control mechanisms that are activated when something seems to be going wrong with its functions, for example, when it receives too much growth stimuli. This makes the cell to "interpret" the excessive stimuli as dangerous and to turn on the control system. (7)

On the contrary, in cancer those controls are lost and cells multiply freely. In some types of cancer, cancer cells start to produce FGFR3 bearing the same mutation which, when occurring spontaneously, causes a more severe and lethal kind of chondrodysplasia, called tanatophoric dysplasia (TD). In TD, FGFR3 is so active that it doesn't need to be turned on by a FGF, it is always active and works alone (what is called constitutive activation).(8) This makes the FGFR3-MAPK pathway extremely active and the cancer cell is driven to multiply without control.

MAPK in chondrocytes 

Chondrocytes seem to be an exception in the rule of MAPK: instead of growing under FGFR3-MAPK influence, they reduce their growth pace and, according to Dr. Krejci, this would be the result of chondrocytes using the quality control system to react to the stimulus given by FGFR3-MAPK. (1,9) The cells using this control system would be entering in what is called a state of cell senescence: they would keep some cell functions but would be unable to multiply (no chondrocyte multiplying = no bone growth). As we mentioned in the previous article, this concept could be questioned: the mutation makes chondrocytes going to senescence, but isn't the normal function of FGFR3 to reduce chondrocyte growth pace? Is the senescence phenomenon being activated in chondrocytes even under normal FGFR3 activation?

I have been thinking in this problem lately and couldn't find a right answer for these questions. Cell senescence is often mediated by a famous control protein called p53. It has a couple of other companions and they are considered the mainstream of this kind of proliferation control. (7) Furthermore, it has been already found that chondrocytes under the influence of MAPK also trigger another control protein called p107. (10)  And finally, it has also been shown that members of the Sprouty family of proteins regulate FGFRs and other cell enzymes and can also trigger senescence. (11) However, it is difficult to say why in normal conditions (think in the normal FGFR3) this control would be turned on in chondrocytes and would be enhanced in cells bearing the mutated receptor. How could this happen?

We already know that FGFR3 is only one of many other players controlling the rhythm of bone growth, most of them acting as positive modulators, including parathyroid hormone and its related peptide (PTH, PTHrP), C-type natriuretic peptide (CNP), growth hormone/insulin growth factor 1 (GH, IGF1) among others.

Perhaps, the sum of all these positive stimuli, added by the extra stimulus given by FGFR3 (remember that FGFR3 is a positive growth stimulator for other cells) is the trigger of these growth control systems in chondrocytes. The question is, either run by p53, p107 or Sprouty proteins these systems are the same in all cells, so why would chondrocytes behave differently?

Well, this would need to be demonstrated.

A final note

In the last article I said that the next one would be about targeting the MAPK pathway to treat achondroplasia. This is the third article or note I published here since then. The topic about chondrocyte senescence is very important and I couldn't help thinking more about it. In the next article, we will be finally reviewing more closely the use of MAPK inhibitors that are being explored in the treatment of cancer to treat achondroplasia.

References

1. Krejci P. The paradox of FGFR3 signaling in skeletal dysplasia: why chondrocytes growth arrest while other cells over proliferate. Mutat Res Rev Mutat Res 2014;759:40-8.

2. Bellus GA et al. Achondroplasia is defined by recurrent G380R mutations of FGFR3. Am J Hum Genet 1995;56(2):368-73. Free access.

3. Colvin J et al. Skeletal overgrowth and deafness in mice lacking fibroblast growth factor receptor 3. Nature Genetics 1996; 12:390-7.

4. Toydemir RM et al. Novel mutation in FGFR3 causes camptodactyly, tall stature, and hearing loss (CATSHL) Syndrome. Am J Hum Genet 2006;79(5):935-41. Free access.

5. Foldynova-Trantirkova S et al. Sixteen years and counting: the current understanding of 
fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) signaling in skeletal dysplasias. Hum Mutat 2012; 33:29–41. Free access.


6. Santarpia L et al. Targeting the Mitogen-activated protein kinase RAS-RAF signaling pathway in cancer therapy. Expert Opin Ther Targets 2012; 16(1): 103–19. Free access.

7. Campisi J & Fagagna FA. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Rev Mol Cell Biol 2007;8:729-40.

8. d'Avis PY et al. Constitutive activation of fibroblast growth factor receptor 3 by mutations responsible for the lethal skeletal dysplasia thanatophoric dysplasia type I. Cell Growth Differ 1998;9(1):71-8. Free access.

9. Krejci et al. FGFR3 signaling induces a reversible senescence phenotype in chondrocytes similar to oncogene-induced premature senescence. Bone 2010; 47:102–10. Free access under certain conditions.

10. Kolupaeva V et al.The B55α regulatory subunit of protein phosphatase 2A mediates fibroblast growth factor-induced p107 dephosphorylation and growth arrest in chondrocytes. Mol Cell Biol 2013;33(15):2865-78.

11. Macià A et al. Sprouty1 induces a senescence-associated secretory phenotype by regulating NFκB activity: implications for tumorigenesis. Cell Death Differ 2014; 21(2):333-43.