Monday, December 12, 2016

Treating Achondroplasia: Phase 3 study with vosoritide started in Australia.

Biomarin, the developer of vosoritide (BMN-111), the first potential therapy for achondroplasia to reach clinical development, has just announced that the first child has been enrolled in the phase 3 study, in Australia.


 This is the press release:

BioMarin Enrolls First Participant in Phase 3 Trial of Vosoritide for Treatment of Children with Achondroplasia


SAN RAFAEL, Calif., Dec. 12, 2016 (GLOBE NEWSWIRE) -- BioMarin Pharmaceutical Inc. (NASDAQ:BMRN) announced today that the company has initiated a global Phase 3 study for vosoritide, an analog of C-type Natriuretic Peptide (CNP), in children with achondroplasia, the most common form of dwarfism. The first child enrolled in the study was at a site in Australia.
"Based on the positive results seen in our Phase 2 study, we look forward to continuing to investigate vosoritide," said Hank Fuchs, M.D., President, Worldwide Research and Development at BioMarin. "We are grateful to the children and their families, who have participated in the earlier study and are participating in this Phase 3 study."
The Phase 3 study is a randomized, placebo-controlled study of vosoritide in approximately 110 children with achondroplasia ages 5-14 for 52 weeks. The study will be followed by a subsequent open-label extension. Children in this study will have completed a minimum six-month baseline study to determine their respective baseline growth velocity prior to entering the Phase 3 study. Vosoritide is being tested in children whose growth plates are still open. This is approximately 25 percent of people with achondroplasia.
The primary endpoint of the study is the change in growth velocity from baseline over one year in children treated compared to placebo.  The company also plans to augment the growth velocity data with assessments of proportionality and functionality.
In addition, BioMarin is planning a separate Phase 2 study evaluating the effect of vosoritide in infants and toddlers. Vosoritide has been granted orphan drug designation in both the United States and Europe.
(...)

Here goes a link for the complete press release:

http://investors.bmrn.com/releasedetail.cfm?ReleaseID=1003715

Thursday, October 20, 2016

Tratando a acondroplasia: resultados da quarta coorte do estudo de fase 2 com vosoritide foram publicados

BioMarin, o desenvolvedor do vosoritide, publicou um comunicado de imprensa em 19 de outubro descrevendo resultados da quarta coorte do estudo de fase 2.

Em resumo, a dose do quarto coorte, 30mcg/kg/dia, embora segura, não foi superior à dose da terceira coorte (15mcg/kg/dia), de modo que o desenvolvedor decidiu utilizar 15mcg/kg/dia como a dose para o próximo estudo de fase 3.

Abaixo, reproduzo as tabelas que mostram os principais resultados divulgados hoje.


Tabela 1.
 
* Crianças com dose aumentada para 15mcg/kg/dia após pelo menos 6 meses a 2,5 e/ou 7,5 mcg/kg/dia; 4 dos 16 indivíduos originais das coortes 1 e 2 não iniciaram a dosagem de 15 mg/kg/dia, devido à decisão do sujeito de se retirar do estudo (2), recusa a entrar no estudo de extensão (1), e fechamento da placa de crescimento (1).
** Uma criança na coorte 4 foi descontinuada do tratamento devido à descoberta de uma anomalia congênita rara de condução identificada no estudo de rotina de monitoramento de ECG, que não foi associada a sintomas, e o paciente foi retirado do tratamento por precaução.

 
Tabela 2. 

* P-valor nominal, não corrigido para multiplicidade.
** A média de mudança de velocidade de crescimento anualizada a partir da linha de base aumenta para 2,0 cm/ano (50% de aumento), se um paciente que perdeu a maioria das doses entre 6 e 12 meses for excluídoa análise.
*** 8 crianças têm velocidade de crescimento anualizada presentes, tanto a linha de base quanto 6 meses.
O comunicado de imprensa completo está aqui.

Wednesday, October 19, 2016

Treating Achondroplasia: results from the fourth cohort of the phase 2 study with vosoritide have been released

Biomarin, the developer of vosoritide published a press release today describing results of the fourth cohort of the phase 2 study. 

In brief, the dose of the fourth cohort, 30mcg/kg/day, although safe, was not superior to the dose of the third cohort (15mcg/kg/day), so the developer decided to use 15mcg/kg/day as the dose for the upcoming phase 3 study.

Below, I reproduce the tables showing the main results divulged today.
*Children increased dose to 15 µg/kg/day after at least 6 months at 2.5 and/or 7.5 µg/kg/day; 4 of original 16 subjects in Cohorts 1 and 2 did not initiate dosing at 15 µg/kg/day due to subject decision to withdraw from the study (2), declining extension study (1), and growth plate closure (1)
**One child in cohort 4 discontinued from treatment due to finding of a rare congenital abnormality of conduction identified on routine study of ECG monitoring, which was not associated with symptoms, and patient was removed from treatment for precautionary reasons.

* Nominal p-value, not adjusted for multiplicity
** Mean Annualized Growth Velocity change from baseline increases to 2.0 cm/year (50% increase) if one patient who missed majority of doses between 6 and 12 months is excluded
***8 children have non-missing annualized growth velocity at both baseline and 6 months.
You can find the complete press release here.


Tuesday, September 27, 2016

Resultados de um ano de tratamento do terceiro grupo do estudo de fase 2 com vosoritide serão apresentados no congresso da ASHG 2016

Os desenvolvedores do vosoritide (BMN-111), a primeira terapia potencial para a acondroplasia, apresentarão mais resultados do estudo de fase 2 que está em andamento durante a próxima reunião da American Society of Human Genetics (ASHG) a ser realizada em Vancouver em outubro.

Este é um link para uma descrição do estudo de fase 2 em ClinicalTrials.gov:
A Phase 2 Study of BMN 111 to Evaluate Safety, Tolerability, and Efficacy in Children With Achondroplasia (ACH).

Em resumo, de acordo com os investigadores, vosoritide tem demonstrado segurança e evidências de eficácia que permitem a continuação do seu desenvolvimento como terapia para a acondroplasia.

Abaixo, os principais resultados:

"Depois de 12 meses utilizando 15 mcg / kg / dia, os indivíduos da coorte 3 tiveram no aumento significativo da média de velocidade de crescimento de 1,9 ± 2,0 cm / ano (46%) em relação aos valores iniciais (p = 0,02) (tradução livre do Autor)."

Em palavras mais simples, o primeiro número, 1,9, é o aumento médio da velocidade de crescimento em relação à medida inicial (dia um) e o segundo número, 2,0 é o desvio padrão, mostrando o intervalo do ritmo da velocidade de crescimento entre os participantes do estudo. A ampla faixa (-2,0 a +2,0) pode ser explicada pelo pequeno número de participantes. Quanto menor for o número de participantes, mais ampla qualquer variação nas medidas pode ser.

O aumento de 46% na velocidade de crescimento relatado agora é mais baixo do que o valor (50%) informado em um reporte anterior sobre os primeiros seis meses de terapia da terceira coorte.

"Doze indivíduos que tiveram suas doses elevadas para 15 mcg/kg/dia durante ≥ 6 meses tiveram um aumento de 2,3 ± 1,9 cm / ano na média de velocidade de crescimento."

É interessante saber que os participantes que estavam nas coortes de doses mais baixas (3,75mcg/Kg/dia e 7,5mcg/Kg/dia) tiveram um aumento maior em sua velocidade de crescimento (65%) comparado com o obtido por aqueles que já estavam em uso dessa dose (
15 mcg/kg/dia).

Para ler o resumo completo dos resultados que serão apresentados na próxima reunião da ASHG em Vancouver em outubro, siga este link (em inglês).


É importante ressaltar que, ao rever comunicados de imprensa anteriores da BioMarin sobre o BMN-111/vosoritide e a acondroplasia percebi que a maioria dos dados fornecidos no resumo acima já havia sido publicada em 20 de abril, aqui.

Uma vez que não foram realmente divulgados novos dados (pelo menos no resumo da apresentação), a atenção agora recai sobre os resultados da quarta coorte, em andamento, que está usando uma dose mais elevada de vosoritide (30mcg/Kg/dia) e como estão os planos para o estudo de fase 3.

Friday, September 23, 2016

Vosoritide one year phase 2 results of the third cohort to be presented in the next ASHG 2016 meeting

The developers of vosoritide (BMN-111), the first potential therapy for achondroplasia, will present further results of the ongoing phase 2 study during the next American Society of Human Genetics (ASHG) Meeting to be held in Vancouver in October.

This is a link to a description of the phase 2 study at ClinicalTrials.gov:  

A Phase 2 Study of BMN 111 to Evaluate Safety, Tolerability, and Efficacy in Children With Achondroplasia (ACH).


In summary, according with the investigators, vosoritide has been showing safety and evidence of efficacy to allow its continuing development as a therapy for achondroplasia.

Main results provided:

  • "After 12 months at 15 μg/kg/day, Cohort 3 subjects had 1.9 ± 2.0 cm/year (46%) increase in mean AGV from baseline (p=0.02)."

In easier words, the first number, 1.9, is the mean increase in growth velocity from baseline (day one) and the second number, 2.0 is the standard deviation, showing the growth velocity pace range among the participants of the study. The wide range can be explained by the small number of participants. The smaller the number of participants the wider any variation in measurements can be.


The 46% increase in growth velocity reported now is lower than the figure (50%) provided in a previous report of the first six months of therapy.

  • "Twelve subjects escalated to 15µg/kg/day for ≥6 months had an increase of 2.3 ± 1.9 cm/year."
It is interesting to learn that the participants who were in the lower dose cohorts (3.75mcg/Kg/day and 7.5mcg/Kg/day) had a further increase in their growth velocity (65%)


To read the complete abstract of the results that will be presented at the upcoming  ASHG meeting in Vancouver on next October, follow this link

Noteworthy, reviewing previous press releases from Biomarin about BMN-111/vosoritide and achondroplasia I found out that most of the data provided in the above mentioned abstract was already published in April 20th, here

Since there is no real new data disclosed (at least in the meeting abstract), the attention now falls over the results of the ongoing fourth cohort, which is using a higher dose of vosoritide (30mcg/Kg/day) and the planned phase 3 study.

Wednesday, July 6, 2016

Tratando la acondroplasia: NVP-BGJ398, un inhibidor de la tirosina quinasa, restaura el crecimiento óseo en un modelo de acondroplasia

Traducción: Maria Cristina Terceros

Para recordar

Éste y los demás artículos del blog intentan explicar la ciencia para terapias en la acondroplasia por detrás de la investigación, con textos adaptados y simplificados para así ayudar en su comprensión, evitando detalles técnicos complejos sobre los tópicos tratados. Para aquéllos que tienen más conocimientos en el área recomiendo que visiten los enlaces que aparecen en todos los textos, así como, si es necesario, las referencias citadas para obtener más informaciones técnicas.

Para los recién llegados, si bien he tratado de simplificar el texto, puede ser
que el lenguaje aquí parezca algo difícil de entender en una primera lectura. No se debe desistir. Tenemos artículos más antiguos en el blog que explican lo que es la acondroplasia, la placa de crecimiento, los condrocitos, el receptor del factor de crecimiento de los fibroblastos tipo 3 (FGFR3), las enzimas y otros tópicos relacionados utilizando analogías, animaciones e imágenes. Lo único que debéis hacer es buscar el índice en el idioma de preferencia para encontrarlos. Mantenga la tranquilidad y echa un vistazo a esos artículos. Aprender sobre el terreno que se está atravesando es bueno para no perderse, especialmente porque éste es un territorio (parcialmente) desconocido.

Un concepto básico


Si, si, lo sé, a los lectores de más tiempo (?) de este blog no les gustará, pero creo que es importante destacar un concepto sencillo sobre la acondroplasia antes de continuar. La acondroplasia es causada por una alteración (mutación) en la estructura de la enzima denominada FGFR3. El FGFR3 es un freno natural del crecimiento óseo, que va reduciendo y equilibrando la aceleración natural del crecimiento óseo producido por otros varios agentes que trabajan en el interior de las placas de crecimiento. Como en la
acondroplasia el FGFR3 funciona en exceso, el resultado es que los huesos no pueden crecer al ritmo y velocidad programados, o crecen con “el freno activado”, dando como resultado las características clínicas de esta displasia esquelética.

Ahora vamos directamente al tema.

Primera pregunta: ¿qué es el inhibidor de la tirosina quinasa (TKI)?

El inhibidor de la tirosina quinasa es una molécula pequeña diseñada para bloquear la actividad de un grupo de enzimas llamadas tirosina quinasas (TK), que actúan a través de reacciones químicas promovidas por el aminoácido tirosina. Nuestra conocido FGFR3 es una tirosina quinasa. En resumen, muchas de estas TKs están fijadas cruzando la membrana celular (Figura 1) y trabajan trasmitiendo, a través de reacciones químicas en sus estructuras, las señales procedentes de fuera de la célula hacia el núcleo celular. Éstas funcionan como antenas de TV y, por su modo de acción, estas TKs, son también denominadas enzimas receptoras (o tirosina-quinasa receptoras, las RTKs).

Figura 1. Las familias de las RTKs.


Estructura esquemática de las principales familias de RTKs humanas. Bacco F et al. http://www.cancer-therapy.org/. Reproduzido aqui somente com fins educativos.

El FGFR3 forma parte de una familia de cuatro RTKs hermanas (1 a 4). Todos los FGFRs tienen una estructura similar (Figura 2): existe una parte colocada fuera de la célula (dominio extracelular), una parte que atraviesa la membrana celular (dominio transmembrana), y una porción intracelular (o el dominio de la tirosina quinasa). Esta porción intracelular es la responsable de la transmisión de señales que provienen del exterior de la célula que va a varias redes de enzimas localizadas en el citoplasma, permitiendo que la célula responda adecuadamente a esta señal. Las señales que son "manejadas" por FGFRs provienen de los FGFs (1).

Figura 2. Estructura del FGFR3.




Como se ha dicho anteriormente, el dominio intracelular del FGFR3 tiene algunos puntos ricos en tirosina. Es importante destacar que las tirosinas se ocultan en una especie de "surco" en la estructura de la enzima, que lleva el nombre de "bolsillo de ATP" (ATP pocket; ATP: adenosina trifosfato).

Bien, ¿pero por qué las tirosinas son tan importantes?

Cuando un FGF se conecta con el FGFR3 fuera de la célula, se produce un cambio en la estructura del FGFR3 dentro de la célula, dando lugar a la apertura del bolsillo de ATP, lo que "expone" a las tirosinas al ambiente local (Animación 1). El tema es que la tirosina es un aminoácido bastante reactivo y el ambiente local es rico en ATPs, moléculas que cargan el ion de fósforo, que también es bastante reactivo. Una atrae a la otra y la reacción resultante entre las tirosinas y ATPs (que tiene el nombre de fosforilación) atrae a las enzimas más jóvenes hacia el vecindario. La reacción química "recorre" de una
enzima a la otra, lo que se denomina como "cascada de señalización". Imaginemos que éstas son cadenas de dominó, una (la señal) empuja un bloque de dominó y los demás seguirán en secuencia, hasta que los últimos alcancen algunos puntos dentro del núcleo para promover una respuesta coordinada desde el núcleo de la célula hasta la señal original. Ver la Animación 2 para seguir una señal desde fuera de la célula hasta el núcleo (la animación es un poco larga, pero instructiva).

Animación 1. Activación de la RTK y reacción con los ATPs (fuente desconocida, de YouTube).




Animación 2. Cascada de señalización.



DNA Learning Center by Cold Spring Harbor Laboratory

Bloqueando las enzimas receptoras

Ahora, imaginemos si pudiésemos colocar una "cinta adhesiva" en el bolsillo del ATP para bloquear el inicio de la reacción en cadena promovida por esas tirosinas. Si no se puede "abrir" el bolsillo, las tirosinas no estarán expuestas y la cascada de señalización se detendrá. Esto es exactamente lo que hace el TKI (Animación 3). Estos son pequeñas moléculas que pueden viajar fácilmente a través de los tejidos y de las membranas celulares y unirse a estos bolsillos de ATP dentro de la célula, bloqueando las funciones de la enzima objetivo o diana.

Animación 3. Mecanismo de acción del lapatinib, un TKI diseñado para inhibir el EGFR2/HER2 (un RTK).




Bien, ¿verdad? Entonces, ¿qué estamos esperando para sencillamente colocar uno de esos TKI que bloqueen el FGFR3 y resolver el problema del crecimiento óseo en la acondroplasia?

El problema es que los FGFRs no son las únicas enzimas que contienen bolsillos de ATP. Por el contrario, existen otras muchas familias de enzimas que los contienen también, y los bolsillos son muy parecidos en todas ellas (Figura 1). Apenas para dar un ejemplo, en el caso de la familia de los FGFRs, más del 60% de la estructura de las cuatro enzimas es parecida entre ellas, incluyendo el formato de los bolsillos de ATP (1). A esta semejanza de la estructura, se le da el nombre de homología.

Desde el momento en el cual fue identificada, muchos TKIs fueron desarrollados. Las primeras generaciones de TKIs contaban con una amplia gama de efectos al unirse a las varias y diferentes familias de enzimas al mismo tiempo (figura 3), de manera que son normalmente denominados medicamentos multiquinasas. Los TKIs más recientes son más específicos, y los desarrollares intentan encontrar la molécula capaz de bloquear apenas
una enzima, o por lo menos solamente enzimas de una determinada familia.

Ésta es una tarea difícil, exactamente debido a la homología de la estructura de estas diferentes enzimas receptoras. Sin embargo, hemos visto una serie de nuevos TKIs anti-FGFR siendo descrita en los últimos años, con menos efecto sobre otras enzimas (ya revisado en el blog).

Figura 3. TKIs antiguos y sus múltiples objetivos o dianas.



Cada bola de color representa una enzima que puede ser inhibida por estos TKIs.

Entonces, ¿los TKIs son buenos para la acondroplasia?

Ésta fue la pregunta publicada recientemente en un artículo de este blog. En aquella revisión, comentábamos sobre el estudio publicado por el grupo del Dr. Pavel Krejci relacionado con el uso de TKIs disponibles en el tratamiento del defecto del crecimiento óseo en la acondroplasia (2). El Dr. Krejci, uno de los investigadores más entusiasmados en el área del FGFR3, es también autor y co-autor de variados y relevantes estudios en los últimos diez años, o más.

Por ejemplo, él fue uno de los investigadores que trabajó en el estudio que validó el péptido natriurético tipo C (CNP) como agente esencial para promover el crecimiento óseo (3), que dio como resultado un fortalecimiento cada vez más grande en el trabajo del desarrollo clínico del vosoritide (BMN-111), que actualmente se encuentra en proceso de prueba (test) en un estudio de fase 2.

Volviendo al estudio de Gudernova et al. (2), el grupo del Dr. Krejci frecuentemente usa un modelo padrón de células de condrosarcoma de rata (RCS, una célula cancerosa de origen cartilaginosa) que, bajo activación del FGFR3, se comporta de manera semejante a los condrocitos de la placa de crecimiento. Ver el video 1 para tenerse una idea de cómo las células RCS se comportan cuando son expuestas al FGF2. En este video podemos inferir
cuales son los efectos de la señalización del FGFR3 sobre los condrocitos.

Video 1. Células RCS responden a estímulos del FGF2. Este modelo celular de FGFR3 reacciona de manera semejante a los condrocitos de la placa de crecimiento De: REACH Registry achondroplasia.



Los investigadores probaron cinco TKIs anti-FGFR disponibles en las células RCS, en un modelo de rata ex-viva (muerta) y también en ratitas recién nacidas, y concluyeron que los TKIs disponibles no serían útiles en el tratamiento de la acondroplasia, debido a que ellos bloquearon otras enzimas y a veces también causaron toxicidad celular.

Al escribir el comentario sobre este estudio, mi sentimiento era de frustración, y la razón es sencilla. El mejor abordaje para el tratamiento de la acondroplasia se daría actuando directamente sobre el receptor afectado por la mutación. El receptor afectado, sería entonces, en teoría, el problema. Si se lo pudiese inhibir o incapacitar, los condrocitos de la placa de crecimiento podrían retomar su comportamiento normal, y podríamos rescatar el crecimiento óseo, minimizando o evitando las características clínicas y las
complicaciones asociadas a esta displasia ósea.

Sólo para dar un ejemplo, vamos a comparar una terapia directa contra el FGFR3 con el actual y más avanzado tratamiento en potencial para la acondroplasia, el análogo del CNP vosotiride. El vosotiride funciona activando otra cascada de enzimas en los condrocitos, que naturalmente inhibe algunos de los efectos del FGFR3. De acuerdo con los resultados disponibles, a partir del estudio de fase 2, que está en proceso, éste ha mostrado eficacia en restaurar la velocidad de crecimiento del hueso de los pacientes incluidos (3). Sin embargo, el CNP compensa apenas los efectos de sólo una de las cascadas químicas desencadenadas por el FGFR3 (Figura 4). Por otro lado, una droga que apunte directamente hacia el receptor mutante, puede potencialmente inhibir la función excesiva de todas las cascadas de señalización activadas por el FGFR3.

FIGURA 4. Cruce de las cascadas del FGFR3 y del CNP.


Transducción de la señal del FGFR3 y estrategias terapéuticas. El FGF y la heparina se unen al dominio extracelular del FGFR3 e inducen a la activación de la quinasa, llevando a la activación de las vías de señalización corriente abajo, así como las cascadas de STAT y MAP quinasa (MAPK). El CNP se une al receptor NPR-B e induce la generación del segundo mensajero cGMP, que activa la PKG, que lleva hacia la atenuación de la vía de la MEK a través de la enzima RAF. Modificado con el permiso de Laederich y Horton (5). Fuente: Fundación Alpe.
 Validación y comparación de resultados

En la última década, diferentes estudios relacionados con la acción farmacológica de los TKIs anti-FGFR ya habían demostrado que éstos pueden bloquear varias enzimas al mismo tiempo, aparte de los FGFRs (como fue explicado anteriormente). Un pequeño número de estudios también mostró resultados conflictivos de TKIs en el crecimiento de los huesos, debido a los efectos “lejos del objetivo” (otras enzimas potencialmente afectadas por el
TKI) (6-9). De esta manera, el estudio del grupo del Dr. Krejci (2) parecía apenas confirmar lo que se supone deba suceder en el interior de la placa de crecimiento, cuando se usa un TKI anti-FGFR.

Por lo tanto, quedé (gratamente) sorprendido y, aliviado también, cuando leí el estudio recientemente publicado por el grupo de la Dra. Laurence Legeai-Mallet (10). Su grupo testeó (probó) el TKI NVP-BGJ398 (BGJ398; Figura 5) (11), una de las moléculas testeadas por el Dr. Krejci, como un potencial abordaje terapéutico en la acondroplasia.

Figura 5. Estructura del BGJ398.



Nuevos aires

Entonces, ahora que contamos con un conocimiento básico de lo que es un TKI y los desafíos acerca de usarlos como una terapia para la acondroplasia, vamos a revisar este estudio bastante interesante con el BGJ398 en la acondroplasia e intentar colocar sus conclusiones en perspectiva. ¿Será que vemos en el horizonte otra solución terapéutica para el tratamiento de la acondroplasia?

Resumidamente, en el estudio de grupo del Dr. Krejci, como ya vimos, ellos trabajaron con modelos in vitro e in vivo, y verificaron que todos los TKIs habían bloqueado, no solamente el FGFR3 en los modelos celulares, sino también otras enzimas, lo que causó toxicidad. Ellos probaron uno de los TKIs, el AZD4547 (12), en ratitas recién nacidas, y descubrieron que, en vez de promover el crecimiento, la droga produjo alteraciones en el crecimiento y también una significativa toxicidad, dependiendo de la dosis y aún de la
muerte de los animales. Considerando todos los resultados en conjunto, la conclusión fue que los TKIs disponibles no podrían ser utilizados en el tratamiento de la acondroplasia, debido a su falta de especificidad y riesgo de toxicidad.

Sin embargo, el estudio trajo más conocimiento sobre las propiedades de esos TKIs, en relación a su capacidad de inhibir muchas RTKs. Una información interesante fue la de que el BGJ398, si bien era capaz de inhibir varias enzimas, lo hizo en dosis mucho más altas de lo necesario, para de una manera particular, inhibir al FGFR3. En otras palabras, el BGJ398 parecía tener más afinidad con el FGFR3 que con todas las demás enzimas probadas, incluyendo los demás miembros de la familia FGFR. Para respetar los derechos
autorales de la publicación, no voy a reproducir la tabla que muestra esta información, pero se puede consultar el artículo y ver la Tabla 1.

Por lo tanto, el estudio del grupo de la Dra. Legeai-Mallet trae nuevos aires al campo, y muestra cómo es importante verificar y confirmar los resultados obtenidos en una investigación anterior.

Rescatando el crecimiento óseo

En resumen, el grupo de la Dra. Legeai-Mallet probó el BGJ398 en varios experimentos de células y tejidos y en un modelo animal de acondroplasia y descubrió que éste era capaz de rescatar el crecimiento óseo y básicamente todas las características clínicas de la acondroplasia. Por ejemplo, el uso de este TKI corrigió, no solamente el atraso de crecimiento de los huesos largos causado pelo FGFR3 mutante, sino también el defecto en la base del cráneo, las vértebras, la bóveda craneal (las sinostosis) y en los discos
intervertebrales.

Veamos este estudio con más detalles.

Primero, los investigadores trabajaron con condrocitos humanos que muestran y manifiestan varios tipos de FGFR3 mutante y descubrieron que el BGJ398 fue capaz de inhibir la fosforilación del FGFR3 (recordemos lo que vimos anteriormente).

A continuación, probaron si variadas y diferentes dosis del BGJ398 serían capaces de rescatar el crecimiento óseo en un cultivo de fémur embrionario y descubrieron que, a una concentración de 100 nM (nano molares), este TKI fue capaz de rescatar el crecimiento óseo completamente. Ellos encontraron resultados bastante parecidos con la misma dosis en un modelo de la base del cráneo.

Hagamos aquí una pequeña pausa para un corto reabastecimiento, para ver el
significado de la palabra nano Molar. Molar es una unidad usada para medir la concentración de una substancia en una determinada solución (o medio). Para fines farmacológicos, cuanto menor la concentración de la dosis necesaria para obtenerse el efecto deseado, mejor es para una terapia en potencial en cualquier campo. De esta manera, es común aceptar que un potencial candidato a droga debe “trabajar” en concentraciones dentro de la franja nanomolar.

Volviendo al estudio, los investigadores probaron el BGJ398 en un modelo de rata con acondroplasia, el mismo que había sido usado para explorar el uso del vosoritide años atrás (13). Ellos probaron en ratas recién nacidas con una dosis subcutánea diaria de 2 mg/kg durante 15 días y verificaron que esta dosis fue bien tolerada, “sin alteración notable del comportamiento" (10).

De acuerdo con el estudio, las ratas pequeñas portadoras de mutación semejante a la de la acondroplasia, tratadas con BGJ398 tuvieron un significativo rescate de su crecimiento óseo en comparación con los animales de control. Sin embargo, es importante notar que, en comparación con animales no afectados, el crecimiento no fue completamente rescatado, como podemos observar en las imágenes y gráficos mostrados en el estudio (guardar estas informaciones para más tarde). No puedo reproducir las imágenes aquí
porque debo respetar los derechos de autor, (el artículo no es de libre acceso).

Ellos también probaron los efectos del BGJ398 en la columna vertebral, en el cráneo y en los discos intervertebrales, incluyendo las sincondrosis y el foramen magno, y verificaron que el fármaco también era capaz de mejorar el crecimiento en todas estas áreas. Esto es relevante porque necesitamos conocer el impacto de cualquier terapia sobre las características clínicas de la acondroplasia.

Un aspecto importante para usarse un TKI anti-FGFR para bloquear el FGFR3, es la posibilidad de hacerse lo mismo en otros FGFRs. El FGFR1 también es producido en la placa de crecimiento, así los investigadores verificaron si el BGJ398 estaba también causando cualquier perturbación en la señalización del FGFR1 y constataron que no era el caso. Esto significa que, con la dosis usada en el estudio, el BGJ398, condujo significativamente a la inhibición solamente del FGFR3.

Ellos todavía verificaron como el BGJ398 estaba trabajando en los condrocitos de la placa de crecimiento. Querían comprobar si las cascadas de enzimas desencadenadas por el FGFR3 habían sido realmente afectadas por este TKI.

También identificaron que las principales vías activadas por el FGFR3, la MAPK y la STAT1 (Figura 6), habían sido inhibidas por el BGJ398. Pudieron también verificar que, usando este TKI, el nivel de señalización de estas vías en las placas de crecimiento de las ratitas portadoras de la mutación de la acondroplasia era comparable al de los animales no afectados (controles).

Figura 6. Principales vías de señalización del FGFR3.



Vías de señalización activadas por el FGF/FGFR. El FGF induce a la dimerización, a la activación de la quinasa y a la transfosforilación de los residuos de tirosina del FGFR, llevando a la activación de las vías de señalización de manera descendiente (hacia abajo). Diferentes vías son estimuladas por la FGF/FGFR, como ser Ras-MAP- quinasa, PI-3 quinasa/AKT y las vías del PLC-y. Aparte de eso, la señalización del FGF también puede estimular la vía de STAT1/p21. La señalización FGF/FGFR también fosforila las proteínas Shc y Src. Los FGF/FGFR desempeñan papeles cruciales en la regulación de la proliferación, diferenciación y en la apoptosis de los condrocitos a través de las vías de señalización de manera descendiente (hacia abajo). De: Su N et al. Bone Res 2014; 2: 14003. Artículo de libre acceso, figura reproducida aquí apenas con fines educativos.
 La cuestión del momento ideal

Como vimos anteriormente, el grupo de la Dra. Legeai-Mallet probó los efectos del BGJ398 durante 15 días en ratas recién nacidas y los resultados fueron bastante relevantes. Sin embargo, ellos no se detuvieron ahí, y también probaron ese TKI en ratas mutantes de más edad. Aunque el fármaco haya presentado efectos positivos en el crecimiento óseo, éstos eran mucho más suaves de lo que fue visto en los animales más jóvenes. Algo también relevante fue, como vimos anteriormente (y puede ser conferido dándole una lectura al estudio), que aun dado en el nacimiento, el rescate del crecimiento óseo con BGJ398 no fue completo, y estamos hablando de un fármaco
proyectado para bloquear directamente el receptor y no uno que actúa indirectamente, por medio de otra vía, como lo hace el CNP.

Los huesos comienzan a crecer tempranamente dentro del útero, y el efecto de la mutación del FGFR3 que lleva a la acondroplasia ya es detectable en el tercer trimestre del embarazo, porque las placas de crecimiento de los huesos, en vez de seguir un programa de crecimiento normal, están “conectadas” en el formato de “freno activado”.

La mayor parte de las consecuencias a largo plazo de la acondroplasia, están ya presentes en el momento del nacimiento.


¿Por qué es esto importante? Porque es probable que, si queremos reducir los efectos de la mutación FGFR3 y ayudar a los niños a crecer mejor, el momento ideal para comenzar cualquier tratamiento para la acondroplasia sería en el nacimiento y, si fuésemos capaces de hacer eso, aún antes, durante el embarazo. Contamos con un ejemplo de que el tratamiento para la acondroplasia en el útero es ya factible. ¿Recuerdan que el grupo japonés que trabaja con la meclizina (14) también probó esa droga en ratas embarazadas y no relató cualquier tipo de toxicidad? Esta estrategia no es imposible (pero sí es probablemente bastante difícil de ser implementada).

Por lo tanto, el momento de comenzar la terapia es fundamental para la acondroplasia.

Terapia indirecta vs. terapia directa

Y por último, pero no lo menos importante, como dijimos anteriormente, los investigadores usaron el mismo modelo de rata que fue usado para probar el vosoritide (13). Al comparar los resultados de ambas terapias concluyeron que el BGJ398 fue superior al análogo del CNP. En otras palabras, el abordaje directo del FGFR3 debe ser mejor que el indirecto.

Al final de cuentas, ¿podremos usar un TKI en el tratamiento de la acondroplasia?

Con base en la evidencia histórica, diríamos que sería arriesgado usar un TKI en el tratamiento de la acondroplasia, debido a la falta de especificidad. Sin embargo, el estudio del grupo de la Dra. Legeai-Mallet en un breve resumen presentado aquí nos muestra que, con los TKIs más recientes que se han desarrollado y probado cuidadosamente, es posible que en un futuro cercano lleguemos a tener otra buena noticia en esta área. Un detalle importante sobre el BGJ398 es que la mayor parte del trabajo pre-clínico con este fármaco, ya fue realizado, porque éste ya se encuentra en estudios clínicos contra el cáncer (ClinicalTrials.gov).

Otra información bastante importante para tomarse en cuenta sobre este estudio es que los investigadores obtuvieron resultados notables sobre el crecimiento óseo en su modelo de acondroplasia, utilizando dosis de BGJ398 de 10 a 100 veces más bajas que las utilizadas para las pruebas (tests) en modelos de cáncer.

En realidad sería interesante entender como la empresa Novartis, desarrolladora del BGJ398, está viendo los resultados obtenidos por el grupo de la Dra. Legeai-Mallet y si este grupo está dispuesto a realizar pruebas en otros modelos pre-clínicos para la acondroplasia. Es probable que, con la riqueza de información ya existente, algunas pocas pruebas (tests) adicionales serían necesarias para validar o no el BGJ398 como un abordaje en potencial para comenzar el desarrollo clínico para la acondroplasia. Sin embargo, algunas preguntas son necesarias. Por ejemplo, ¿existen algunas señales de toxicidad no mostradas en las pruebas ya realizadas?

Sí o No (go/no go)

En el tiempo de las terapias-objetivo (diana), ambos, tanto los reguladores como la industria, unidos, deben cambiar sus mentalidades para permitir que nuevas terapias lleguen a enfermedades anteriormente intocables. La decisión de proseguir con el desarrollo clínico de un fármaco en potencial(go/no go) es difícil, y está basada en muchos parámetros diferentes. En una interesante revisión sobre el tema, publicada hace dos años, los autores mencionaron cinco ítems (llamados cinco Rs, de la palabra Right, correcto en inglés) que necesitarían de evaluación para saberse cual era la oportunidad de que un determinado candidato a medicamento fuese bien sucedido y llegase al mercado (15). Será que nosotros (quien desarrolla el medicamento)contamos con el:

1. Objetivo correcto (¿estamos apuntando al objetivo correcto en esa enfermedad en particular?)
2. Paciente correcto (¿tenemos a los pacientes correctos para probar el fármaco?)
3. Tejido correcto (¿estamos probando el fármaco en las células y en los tejidos correctos?)
4. Seguridad correcta (¿estamos seguros sobre el perfil de seguridad del fármaco?)
5. Potencial comercial correcto (¿estamos seguros que permitirá un buen retorno a la inversión realizada?)

Sin embargo, la toma de decisión no se restringe a esos cinco ítems, sino que también se relaciona con cuanto el desarrollador estaría dispuesto a asumir el “riesgo” de fracaso de este nuevo fármaco, el cual podría costar hasta cientos de millones de dólares. En otras palabras, puede ser difícil decidir si esa nueva terapia en potencial es un riesgo o una oportunidad de negocio. Muchas de las grandes industrias farmacéuticas son contrarias, se oponen a asumir riesgos en áreas donde la experiencia es rara, o el territorio no se encuentra bien mapeado. In dubio, prohibere (En la duda, prohibir).

Ya hemos examinado los desafíos para el desarrollo de fármacos en los artículos anteriores en el blog. Existen en el horizonte terapias en potencial para la acondroplasia aguardando la actitud o mentalidad correcta para ser más desarrolladas y, posiblemente, llegar a los niños que las necesiten.

¿Quién será que va a asumir la tarea?

Nota

En el próximo artículo vamos a hablar un poco más sobre el desarrollo de medicamentos y el momento adecuado para iniciar la terapia en la acondroplasia. El artículo prometido sobre el uso de la edición de genes para la acondroplasia vendrá a continuación.

Referencias

1. Ornitz DM and Marie PJ. Fibroblast growth factor signaling in skeletal development and disease. Genes Develop 2015;29:1463–86. Acceso libre.

2. Gudernova I et al. Multikinase activity of fibroblast growth factor receptor (FGFR) inhibitors SU5402, PD173074, AZD1480, AZD4547 and BGJ398 compromises the use of small chemicals targeting FGFR catalytic activity for therapy of short-stature syndromes. Hum Mol Genet 2016; 25(1):9-23.

3. Pavel Krejci at al. Interaction of fibroblast growth factor and C-natriuretic peptide signaling in regulation of chondrocyte proliferation and extracellular matrix homeostasis. J Cell Sci 2005;118 (21):5089-100. Acceso libre.

4. Irving M et al. Vosoritide (BMN 111) in children with achondroplasia: Results from a Phase 2, open label,sequential cohort, dose escalation study. Abstract presented at the American Society of Bone and Mineral Research 2015 Meeting. Presentation Number: LB-1154. October 12, 2015.

5. Laederich MB and Horton WA. FGFR3 targeting strategies for achondroplasia. Exp Rev Mol Med 2012;14:e11.

6. Brown AP et al. Cartilage dysplasia and tissue mineralization in the rat following administration of a FGF receptor tyrosine kinase inhibitor. Toxicol Pathol 2005;33: 449–55.

7. Rastogi MV et al. Imatinib mesylate causes growth deceleration in pediatric patients with chronic myelogenous leukemia. Pediatr Blood Cancer 2012;59:840–45.

8. Tauer JT et al. Impact of long-term exposure to the tyrosine kinase inhibitor imatinib on the skeleton of growing rats. PLoS One 2015;24;10(6):e0131192. Acceso libre.

9. Hall AP et al. Femoral Head Growth Plate Dysplasia and Fracture in Juvenile Rabbits Induced by Off-target Antiangiogenic Treatment. Toxicol Pathol 2016.pii: 192623316646483. [Epub ahead of print].

10. Komla-Ebri D et al. Tyrosine kinase inhibitor NVP-BGJ398 functionally improves FGFR3-related dwarfism in mouse model. J Clin Invest 2016;126(5):1871-84.

11. Guagnano V et al. Discovery of 3-(2,6- dichloro-3,5- dimethoxy-phenyl)- 1-{6-[4- (4-ethyl- piperazin-1- yl)-phenylamino]- pyrimidin-4- yl}-1- methyl-urea (NVP-BGJ398), a potent and selective inhibitor of the fibroblast growth factor receptor family of receptor tyrosine kinase. J Med Chem 2011;54(20):7066-83.

12. Gavine PR et al. AZD4547: an orally bioavailable, potent, and selective inhibitor of the fibroblast growth factor receptor tyrosine kinase family. Cancer Res 2012;72(8):2045-56.

13. Lorget F et al. Evaluation of the therapeutic potential of a CNP analog in a Fgfr3 mouse model recapitulating achondroplasia. Am J Hum Genet 2012;91(6):1108-14. Acceso libre.

14. Matsushita M et al. Meclozine promotes longitudinal skeletal growth in transgenic mice with achondroplasia carrying a gain-of- function mutation in the FGFR3 gene. Endocrinology 2015;156(2):548-54.

15. Cook D et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca’s drug pipeline: a five-dimensional framework. Nature Rev Drug Disc 2014; 13: 419-31.

Wednesday, June 15, 2016

Tratando a acondroplasia: NVP-BGJ398, um inibidor de tirosina quinase, restaura o crescimento ósseo em um modelo de acondroplasia

Para lembrar

Este artigo e os outros no blog buscam explicar a ciência por trás da pesquisa para terapias para a acondroplasia com textos adaptados e simplificados a fim de ajudar sua compreensão, evitando detalhes técnicos complexos sobre os tópicos discutidos. Para aqueles que têm mais conhecimento na área recomendo que visitem os links fornecidos em todos os textos bem como as referências citadas para obter mais informações técnicas, se necessário.

Para os recém-chegados, embora eu tenha buscado simplificar o texto, pode ser que a linguagem aqui pareça um pouco difícil de entender em uma primeira leitura. Não desista. Temos artigos mais antigos no blog que explicam a acondroplasia, a placa de crescimento, condrócitos, o receptor do fator de crescimento de fibroblastos 3 (FGFR3), enzimas e outros tópicos relacionados usando analogias, animações e imagens. Você tem apenas que procurar o índice no idioma de sua preferência para encontrá-los. Fique tranquilo e confira esses artigos.Aprender sobre o terreno que estamos atravessando é bom para que não nos percamos, especialmente porque este é um território (parcialmente) desconhecido.

Um conceito básico

Eu sei, eu sei, os leitores mais velhos (?) deste blog não gostarão, mas acho importante destacar um conceito simples sobre a acondroplasia antes de continuar. A acondroplasia é causada por uma alteração na estrutura (uma mutação) da enzima chamada FGFR3. O FGFR3 é um freio natural do crescimento ósseo, reduzindo e equilibrando a aceleração natural do crescimento ósseo produzida por vários outros agentes que trabalham no interior das placas de crescimento. Como na acondroplasia o FGFR3 está funcionando em excesso, o resultado é que os ossos não podem crescer no seu ritmo programado, ou crescem com “freio puxado”, resultando nas características clínicas desta displasia esquelética.

Agora, direto ao tema. 

Primeira pergunta: o que é um inibidor da tirosina-quinase (TKI)?

Um inibidor da tirosina quinase é uma pequena molécula desenhada para bloquear a atividade de um grupo de enzimas denominadas tirosina-quinases (TK), que funcionam por meio de reações químicas promovidas pelo aminoácido tirosina. O nosso conhecido FGFR3 é uma tirosina-quinase.

Em resumo, muitas dessas TKs estão fixadas cruzando a membrana celular (Figura 1) e trabalham transmitindo, através de reações químicas em suas estruturas, os sinais que vêm a partir do exterior da célula ao núcleo celular. Elas funcionam como antenas de TV e, pelo seu modo de ação, essas TKs também são chamadas de enzimas receptoras (ou tirosina-quinase receptoras, RTKs).

Figura 1. As famílias de RTKs.


Estrutura esquemática das principais famílias de RTKs humanas. Bacco F et al. http://www.cancer-therapy.org/. Reproduzido aqui somente com fins educativos.
O FGFR3 faz parte de uma família de quatro RTKs irmãs (1 a 4). Todos os FGFRs apresentam uma estrutura similar (Figura 2): há uma porção colocada no exterior da célula (domínio extracelular), uma parte que atravessa a membrana da célula (domínio transmembrana), e uma porção intracelular (ou o domínio de tirosina-quinase). Esta porção intracelular é a responsável pela transmissão do sinal vindo do exterior da célula a várias redes de enzimas localizadas no citoplasma, permitindo que a célula responda adequadamente a esse sinal. Sinais que são "gerenciados" por FGFRs vêm de FGFs (1).

Figura 2. Estrutura do FGFR3.




Como já foi dito, o domínio intracelular do FGFR3 tem alguns pontos ricos em tirosina. Importante, as tirosinas estão escondidas numa espécie de "sulco" na estrutura da enzima, que é chamado de "bolso de ATP" (ATP pocket; ATP: adenosina trifosfato).

Bem, por que as tirosinas são tão importantes?

Quando um FGF conecta com o FGFR3 fora da célula, ocorre uma mudança na estrutura do FGFR3 no interior da célula, levando à abertura do bolso de ATP, o que “expõe" as tirosinas no ambiente local (Animação 1). A questão é que a tirosina é um aminoácido muito reativo e o ambiente local é rico em ATPs, moléculas que carregam o íon fósforo, que também é muito reativo. Uma atrai a outra e a reação resultante entre as tirosinas e ATPs (chamada de fosforilação) atrai mais novas enzimas para a vizinhança. A reação química "percorre" de uma enzima para a outra, o que é chamado de “cascata de sinalização". Imagine que essas são como cadeias de dominó, você (o sinal) empurra um bloco de dominó e os outros seguirão em sequência, até os últimos alcançarem alguns pontos dentro do núcleo para promover uma resposta coordenada do núcleo da célula àquele sinal original. Assista a Animação 2 para seguir um sinal desde de fora da célula até o núcleo (a animação é um pouco longa, mas instrutiva).

Animação 1. Ativação da RTK e a reação com os ATPs (fonte desconhecida, do YouTube).





Animação 2. Cascata de sinalização.

http://content.dnalc.org/content/c16/16877/cell_signals.mp4
DNA Learning Center by Cold Spring Harbor Laboratory

Bloqueando enzimas receptoras


Agora, imagine se pudéssemos colocar uma “fita colante” sobre o bolso de ATP para bloquear o início da reação em cadeia promovida por essas tirosinas. Se você não puder "abrir" o bolso, as tirosinas não serão expostas e a cascata de sinalização vai parar. Isto é exatamente o que o TKI faz (Animação 3). Eles são pequenas moléculas que podem trafegar facilmente através de tecidos e membranas celulares e se ligar a esses bolsos de ATP dentro da célula, bloqueando as funções da enzima-alvo.

Animação 3. Mecanismo de ação do lapatinib, um TKI concebido para inibir EGFR2 / HER2 (um RTK).



Bom, não é? O que estamos esperando para simplesmente por um desses TKI para bloquear o FGFR3 e resolver o distúrbio do crescimento ósseo na acondroplasia?

O problema é que os FGFRs não são as únicas enzimas que contêm bolsos de ATP. Pelo contrário, há várias outras famílias de enzimas que os contêm, também, e os bolsos são muito semelhantes em todas elas (Figura 1). Apenas para dar um exemplo, no caso da família dos FGFRs, mais de 60% da estrutura das quatro enzimas é similar entre elas, incluindo a forma dos bolsos de ATP (1). Esta semelhança ou similaridade da estrutura é chamada de homologia.

Desde a sua identificação, muitos TKIs já foram desenvolvidos. As primeiras gerações de TKIs tinham uma ampla gama de efeitos ao se ligarem a várias famílias de enzimas diferentes ao mesmo tempo (Figura 3), de modo que são normalmente chamados de medicamentos multiquinases. Os TKIs mais recentes são mais específicos, e os desenvolvedores tentar encontrar a molécula capaz de bloquear apenas uma enzima, ou pelo menos apenas enzimas de uma determinada família. Esta é uma tarefa difícil, exatamente por causa da homologia da estrutura destas diversas enzimas receptoras. No entanto, temos visto uma série de novos TKIs anti- FGFR sendo descrita nos últimos anos, com menos efeito sobre outras enzimas (já revisto no blog).

Figura 3. TKIs antigos e seus múltiplos alvos.


Cada bola colorida representa uma enzima que pode ser inibida por estes TKIs.

Então, os TKIs são bons para a acondroplasia?

Esta foi a pergunta em um artigo recente publicado neste blog. Naquela revisão, comentamos sobre o estudo publicado pelo grupo do Dr. Pavel Krejci sobre o uso de TKIs disponíveis para tratar o defeito do crescimento ósseo na acondroplasia (2). O Dr. Krejci é um dos pesquisadores mais entusiastas no campo do FGFR3, e autor ou co-autor de vários estudos relevantes nos últimos dez anos ou mais. Por exemplo, ele foi um dos pesquisadores que trabalharam no estudo que validou o peptídeo natriurético tipo C (CNP) como agente essencial para promover o crescimento ósseo (3), o que resultou em fortalecer ainda mais o trabalho de desenvolvimento clínico do vosoritide (BMN-111), que está agora sendo testado em um estudo de fase 2.

Voltando ao estudo de Gudernova et al. (2), o grupo do Dr. Krejci frequentemente usa um modelo padrão de células de condrossarcoma de rato (RCS, uma célula cancerosa de origem cartilaginosa) que, sob a ativação do FGFR3, se comporta de forma semelhante aos condrócitos da placa de crescimento. Assista ao vídeo 1 para ter uma ideia de como as células RCS se comportam quando expostas ao FGF2. Neste vídeo podemos inferir quais o efeitos da sinalização do FGFR3 sobre os condrócitos.

Vídeo 1. Células RCS respondem a estímulos do FGF2. Este modelo celular de FGFR3 reage de forma semelhante aos condrócitos da placa de crescimento. De: REACH Registry achondroplasia.



Os pesquisadores testaram cinco TKIs anti-FGFR disponíveis nas células RCS, em um modelo de rato ex-vivo e também em camundongos recém-nascidos e concluiram que os TKIs disponíveis não seriam úteis para tratar a acondroplasia, porque eles bloquearam outras enzimas e às vezes também causaram toxicidade celular.

Ao escrever o comentário sobre este estudo meu sentimento era de frustração e a razão é simples. A melhor abordagem para o tratamento da acondroplasia seria agir diretamente sobre o receptor afetado pela mutação. O receptor afetado é o problema então, em teoria, se você pudesse inibí-lo ou incapacitá-lo, os condrócitos da placa de crescimento poderiam retomar seu comportamento normal e poderíamos ter resgate do crescimento ósseo, minimizando ou evitando as características clínicas e complicações associadas a esta displasia óssea.

Só para dar um exemplo, vamos comparar uma terapia direta contra o FGFR3 com o atual potencial tratamento mais avançado para a acondroplasia, o análogo do CNP vosoritide. O vosoritide funciona ativando uma outra cascata de enzimas nos condrócitos que naturalmente inibe alguns dos efeitos do FGFR3. De acordo com os resultados disponíveis a partir do estudo de fase 2 que está em andamento, ele tem mostrado eficácia em restaurar a velocidade de crescimento do osso dos pacientes incluídos (4). No entanto, o CNP compensa apenas os efeitos de apenas uma das cascatas químicas desencadeadas pelo FGFR3 (Figura 4). Por outro lado, uma droga que vise diretamente o receptor mutante pode potencialmente inibir a função excessiva de todas as cascatas de sinalização ativadas pelo FGFR3.

FIGURA 4. Entroncamento das cascatas do FGFR3 e do CNP.


Transdução do sinal do FGFR3 e estratégias terapêuticas. O FGF e a heparina se ligam ao domínio extracelular do FGFR3 e induzem a ativação da cinase, levando à ativação de vias de sinalização a jusante, tais como as cascatas STAT e MAP quinase (MAPK). O CNP se liga ao receptor NPR-B e induz a geração do segundo mensageiro cGMP, que ativa a PKG, que conduz à atenuação da via da MEK através da enzima RAF. Modificado com a permissão de Laederich e Horton (5). Fonte: Fundación Alpe.
 
Validação e comparação de resultados

Na última década, vários estudos relacionados com a ação farmacológica de TKIs anti-FGFR já demonstraram que eles podem bloquear várias enzimas além dos FGFRs ao mesmo tempo (como explicado acima). Um pequeno número de estudos também mostrou resultados conflitantes de TKIs no crescimento dos ossos por causa dos efeitos "fora-do-alvo" (outras enzimas potencialmente afetadas pelo TKI) (6-9). Assim, o estudo do grupo do Dr. Krejci (2) parecia apenas confirmar o que se supõe deve acontecer no interior da placa de crescimento quando se utiliza um TKI anti-FGFR.

Portanto, fiquei (positivamente) surpreso e, aliviado também, quando li o estudo recentemente publicado pelo grupo da Dra. Laurence Legeai-Mallet (10). O seu grupo testou o TKI NVP-BGJ398 (BGJ398; Figura 5) (11), uma das moléculas testadas pelo Dr. Krejci, como uma potencial abordagem terapêutica para a acondroplasia.

Figura 5. Estrutura do BGJ398.


Da Wikimedia

Novos ares

Então, agora que temos um conhecimento básico do que é um TKI e os desafios acerca de usá-los como uma terapia para a acondroplasia, vamos rever este estudo muito interessante com o BGJ398 na acondroplasia e tentar colocar suas conclusões em perspectiva. Será que temos outra solução terapêutica para a acondroplasia no horizonte?
 
Resumidamente, no estudo de grupo Dr. Krejci, como já vimos, eles trabalharam com modelos in vitro e in vivo e verificaram que todos os TKIs bloquearam não só o FGFR3 nos modelos celulares, mas também outras enzimas, o que causou toxicidade. Eles testaram um dos TKIs, o AZD4547 (12), em ratinhos recém-nascidos, e descobriram que, em vez de promover o crescimento, a droga produziu alterações no crescimento e também toxicidade significativa dependendo da dose e mesmo a morte dos animais. Considerando todos os resultados em conjunto, a conclusão foi de que os TKIs disponíveis não poderiam ser utilizados para tratar a acondroplasia, devido à sua falta de especificidade e risco de toxicidade.


No entanto, o estudo trouxe mais conhecimento sobre as propriedades desses TKIs, em relação à sua capacidade de inibir muitas RTKs. Uma informação interessante foi a de que o BGJ398, embora capaz de inibir várias enzimas, o fez em doses muito mais altas do que as necessárias para particularmente inibir o FGFR3. Em outras palavras, o BGJ398 parecia ter mais afinidade com o FGFR3 do que com todas as outras enzimas testadas, incluindo os outros membros da família FGFR. Para respeitar os direitos autorais da publicação, não vou reproduzir a tabela que mostra esta informação, mas você pode consultar o artigo e ver a Tabela 1.

Mantendo as informações acima em mente, vamos visitar o estudo do grupo da Dra. Legeai-Mallet, o qual traz novos ares ao campo, e mostra como é importante verificar e confirmar os resultados obtidos em uma pesquisa anterior.

Resgatando o crescimento ósseo 

Em resumo, o grupo da Dra. Legeai-Mallet testou o BGJ398 em vários experimentos de células e tecidos e em um modelo animal de acondroplasia e descobriu que ele era capaz de resgatar o crescimento ósseo e basicamente todas as características clínicas da acondroplasia. Por exemplo, o uso deste TKI corrigiu não só o atraso de crescimento do ossos longos causados pelo FGFR3 mutante mas também o defeito na base do crânio, vértebras, calvária (as sinostoses) e nos discos intervertebrais.

Vejamos este estudo com mais detalhes.

Primeiro, os pesquisadores trabalharam em condrócitos humanos que expressam vários tipos de FGFR3 mutante e descobriram que o BGJ398 foi capaz de inibir a fosforilação do FGFR3 (lembra-se do que revimos acima?).

Em seguida, testaram se várias doses diferentes do BGJ398 seriam capazes de resgatar o crescimento ósseo em uma cultura de fémur embrionário e descobriram que, a uma concentração de 100 nM (nanomolar), este TKI foi capaz de resgatar o crescimento ósseo completamente. Eles encontraram resultados muito semelhantes com a mesma dose num modelo de calvária.

Pausa para um curto pit stop aqui para ver o que significa nano Molar. Molar é uma unidade usada para medir a concentração de uma substância numa dada solução (ou meio). Para fins farmacológicos, quanto menor a concentração da dose necessária para obter um efeito desejado, melhor é para uma terapia potencial em qualquer campo. Assim, é comum aceitar que um potencial candidato a droga deve "trabalhar" em concentrações dentro da faixa nanomolar.

Voltando ao estudo, os investigadores testaram o BGJ398 em um modelo de rato com acondroplasia, o mesmo usado para explorar o uso do vosoritide anos atrás (13). Eles testaram camundongos recém-nascidos com uma dose subcutânea diária de 2 mg/kg durante 15 dias e verificaram que esta dose foi bem tolerada, "sem alteração notável do comportamento" (10).

De acordo com o estudo, os ratinhos portadores da mutação semelhante a da acondroplasia tratados com BGJ398 tiveram um resgate significativo de seu crescimento ósseo em comparação com os animais de controle. No entanto, é importante notar que, em comparação com animais não-afetados, o crescimento não foi completamente resgatado, como podemos ver nas imagens e gráficos mostrados no estudo (Figura 6; guarde estas informações para mais tarde).

Figura 6. O NVP-BGJ398 melhora o crescimento do esqueleto apendicular em camundongos Fgfr3Y367C/+.

(A) Radiografia de membros anteriores de FGFR3+/+ e Fgfr3Y367C/+ tratados e não tratados. Barra de escala: 1 cm. (B) Radiografia dos membros posteriores tratados e não tratados FGFR3+/+ e Fgfr3Y367C/+. (C) comprimentos de fêmur, tíbia, úmero, ulna e rádio (FGFR3+/+, n=13-14; Fgfr3Y367C/+ não tratados, n=9-10; Fgfr3Y367C/+ tratados , n=12-13). *P<0,05, 1-way ANOVA. (D) 2D μCT de distal do fêmur metáfise área de corte transversal. Barra de escala: 400? m. (E) μCT 3D da área em corte transversal da metáfise distal do fêmur. Barra de escala: 400 µm. (F) área mineral óssea total na metáfise do fémur distal (FGFR3+/+, n=8; Fgfr3Y367C/+não tratados, n=8; Fgfr3Y367C/+ tratados, n=6). *P<0,05, 1-way ANOVA. Todos os dados são de animais tratados com o protocolo 1 (16 dias de idade). Os dados são expressos como média ± DP. De: Komla-EBRI D et al. J Clin Invest 2016; 126 (5): 1871-1884. Este artigo tem acesso livre. Figura reproduzida aqui apenas para fins educacionais.

Eles também testaram os efeitos do BGJ398 na coluna vertebral, crânio e discos intervertebrais, incluindo as sincondroses e o foramen magno, e verificaram que a droga também foi capaz de melhorar o crescimento em todas estas áreas. Isso é relevante porque precisamos conhecer o impacto de qualquer terapia sobre as características clínicas da acondroplasia.

Um aspecto importante de se utilizar um TKI anti-FGFR para bloquear o FGFR3, é a possibilidade de se estar fazendo o mesmo em outros FGFRs. O FGFR1 também é produzido na placa de crescimento, assim os investigadores verificaram se o BGJ398 também estava causando qualquer perturbação na sinalização do FGFR1 e constataram que não era o caso. Isto significa que, com a dose utilizada no estudo o BGJ398 inibiu significativamente somente o FGFR3.

Eles ainda verificaram como o BGJ398 estava trabalhando nos condrócitos da placa de crescimento. Eles queriam checar se as cascatas de enzimas desencadeadas pelo FGFR3 foram realmente afetadas por este TKI. Eles identificaram que as principais vias ativadas pelo FGFR3, a MAPK e a STAT1 (Figura 7), foram inibidas pelo BGJ398. Eles puderam também verificar que, usando este TKI, o nível de sinalização destas vias nas placas de crescimento dos ratinhos portadores da mutação da acondroplasia eram comparáveis ​​aos dos animais não afetados (controles).

Figura 7. Principais vias de sinalização do FGFR3.


Vias de sinalização ativadas pelo FGF/FGFR. O FGF induz a dimerização, a ativação da cinase e transfosforilação de resíduos de tirosina do FGFR, conduzindo à ativação de vias de sinalização a jusante. Várias vias são estimuladas pela sinalização FGF/FGFR, tais como Ras-MAP-cinase, PI-3 quinase /AKT e vias de PLC-y. Além disso, a sinalização do FGF também pode estimular a via de STAT1/p21. A sinalização FGF / FGFR também fosforila a proteína Shc e Src. FGF / FGFR desempenham papéis cruciais na regulação da proliferação, diferenciação e apoptose de condrócitos através de vias de sinalização a jusante. De: Su N et al. Bone Res 2014; 2: 14003. Artigo de livre acesso, figura reproduzida aqui apenas para fins educacionais.


A questão do momento ideal

O grupo da Dr. Legeai-Mallet, como vimos, testou os efeitos do BGJ398 por 15 dias em ratos recém-nascidos e os resultados foram muito relevantes. No entanto, eles não pararam ali e também testaram esse TKI em camundongos mutantes mais velhos. Embora a droga tenha apresentado efeitos positivos no crescimento ósseo, esses eram muito mais suaves do que o que foi visto nos animais mais jovens. O que também foi relevante foi, como vimos acima (e você pode conferir lendo o estudo), que mesmo dado no nascimento, o resgate do crescimento ósseo com BGJ398 não foi completo (Figura 6), e estamos falando de uma droga projetada para bloquear diretamente o receptor e não uma que age indiretamente, através de outra via, como faz o CNP.

Ossos começam a crescer cedo no útero e o efeito da mutação do FGFR3 que leva à acondroplasia já é detectável no terceiro trimestre da gravidez, porque as placas de crescimento dos ossos, em vez de seguir o programa de crescimento normal, estão “ligadas” em modo de "freio puxado".

A maior parte das consequências de longo prazo da acondroplasia já estão presentes no nascimento.

Por que isso é importante? Porque é provável que, se quisermos reduzir os efeitos da mutação do FGFR3 e ajudar as crianças a crescer melhor, o momento ideal para iniciar qualquer tratamento para a acondroplasia seria no nascimento e, se fôssemos capazes de fazer isso, mesmo antes, durante a gravidez. Já temos um exemplo de que o tratamento da acondroplasia no útero seria possível. Você lembra que o grupo japonês que trabalha com a meclizina (14) também testou essa droga em ratas grávidas e não relatou qualquer toxicidade? Essa estratégia não é impossível (mas provavelmente muito difícil de implementar).

A hora de começar a terapia é, portanto, fundamental para a acondroplasia.

Terapia indireta vs. direta

E por último, mas não menos importante, como dissemos, os pesquisadores usaram o mesmo modelo de rato usado para testar o vosoritide (13). Ao comparar os resultados de ambas as terapias eles concluíram que o BGJ398 foi superior ao analógo do CNP. Em outras palavras, a abordagem direta do FGFR3 deve ser melhor do que a indireta.

Afinal, podemos usar um TKI para tratar a acondroplasia?

Com base na evidência histórica, diríamos que seria arriscado usar um TKI para tratar a acondroplasia por causa da falta de especificidade. No entanto, o estudo do grupo da Dra. Legeai-Mallet brevemente resumido aqui mostra-nos que, com os TKIs mais recentes sendo desenvolvidos e testados cuidadosamente, é possível que venhamos a ter mais uma boa notícia nesta área no futuro próximo. Um detalhe importante sobre o BGJ398 é que a maior parte do trabalho pré-clínico com essa droga já foi feito, porque ela já está em estudos clínicos para varios tipos de câncer (ClinicalTrials.gov).

Outra informação muito importante para ter em mente sobre este estudo é que os pesquisadores obtiveram resultados notáveis ​​sobre o crescimento ósseo em seu modelo de acondroplasia utilizando doses de BGJ398 10 a 100 vezes mais baixas do que as utilizadas para os testes em modelos de câncer.

Na verdade, seria interessante entender como a Novartis, o desenvolvedor do BGJ398, está enxergando os resultados obtidos pelo grupo da Dra. Legeai-Mallet e se eles estão dispostos a realizar testes em outros modelos pré-clínicos, examinando, especificamente, os efeitos desta TKI em animais mais jovens, com o objetivo de levá-la ao desenvolvimento clínico para a acondroplasia. É provável que, com a riqueza de informação já existente, alguns poucos testes adicionais seriam necessários para validar ou não BGJ398 como uma abordagem potencial para entrar desenvolvimento clínico para acondroplasia. Algumas perguntas são necessárias, no entanto. Por exemplo, existem quaisquer sinais de toxicidade não mostrados nos testes já realizados?

Sim ou Não (go/no go)

Na era das terapias-alvo dirigidas, tanto as agências regulatórias quanto a indústria como um todo devem mudar mentalidades para permitir que novas terapias cheguem em doenças intocadas.

A decisão de prosseguir com o desenvolvimento clínico de uma droga potencial (go/no go) é difícil e baseada em muitos parâmetros distintos. Em uma interessante revisão sobre o tema publicada há dois anos atrás os autores listaram cinco itens (chamados cinco Rs, da palavra Right, certo em inglês) que precisariam de avaliação para se saber qual a chance de um determinado candidato a medicamento ser bem sucedido e chegar ao mercado (15). Será que nós (o desenvolvedor) temos o:

1. Alvo certo (estamos mirando no alvo certo naquela determinada doença?)
2. Paciente certo (temos os pacientes certos para testar a droga?)
3. Tecido certo (estamos testando a droga nas células e tecidos certos?)
4. Segurança certa (estamos certos sobre o perfil de segurança da droga?)
5. Potencial comercial certo (que irá permitir um bom retorno de investimentos?)


No entanto, a tomada de decisão não se restringe a esses cinco itens, mas também se relaciona com o quanto o desenvolvedor está disposto a assumir o "risco" de fracasso desse novo fármaco, o qual poderia custar centenas de milhões de dólares. Em outras palavras, pode ser difícil decidir se essa nova terapia potencial é um risco de negócio ou uma oportunidade de negócio. Muitas da grandes indústrias farmacêuticas são avessas a assumir riscos em áreas onde a experiência é rara ou o território não está bem mapeado. In dubio, prohibere.

Já revimos os desafios para o desenvolvimento de drogas em artigos anteriores no blog. Há potenciais terapias para a acondroplasia no horizonte aguardando novas iniciativas para serem mais desenvolvidas e, possivelmente, alcançar as crianças em necessidade. Quem vai assumir a tarefa?

Nota

No próximo artigo vamos falar um pouco mais sobre o desenvolvimento de medicamentos e o momento adequado para iniciar a terapia na acondroplasia. O artigo prometido sobre o uso da edição de genes para acondroplasia virá a seguir. 

Referências 

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